利拉鲁肽通过抑制NLRP3炎症小体信号通路改善脓毒症小鼠脑损伤

Liraglutide Ameliorates Brain Injury in Septic Mice by Inhibiting NLRP3 Inflammasome Signaling Pathway

摘要

目的 研究利拉鲁肽对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的脓毒症小鼠脑损伤的保护作用及机制。方法 90只C57BL/6小鼠,随机分为3组(n=30):对照组(Control),脓毒症组(LPS),LPS+利拉鲁肽组(LPS+Lira)。LPS组和LPS+Lira组腹腔注射LPS(15 mg/kg),Control组注射等量生理盐水。LPS+Lira组小鼠在LPS注射前2天皮下注射利拉鲁肽(200 μg/kg),每天2次,连续3 d。结果 3组小鼠的生存率、脑含水量、海马CA1区正常锥体细胞数、细胞凋亡率、氧化应激指标、炎症因子水平及相关蛋白表达水平进行比较,差异均具有统计学意义(P <0.05)。进一步两两比较显示,LPS组比Control组的生存率降低(P <0.05),脑含水量增加(P <0.05),海马CA1区正常锥体细胞数减少(P <0.05),细胞凋亡率增加(P <0.05),氧化应激和炎症因子水平升高(P <0.05),NLRP3、Casp1 p10、Caspase-3和Bax蛋白表达水平均增加(P <0.05),Bcl-2表达减少(P <0.05)。LPS+Lira组小鼠的各项指标较LPS组均明显改善(P <0.05)。结论 利拉鲁肽通过抑制NLRP3/Caspase-1信号通路的激活,可减轻炎症反应、氧化应激及细胞凋亡,对LPS诱导的脓毒症脑损伤具有明显保护作用。

Abstract

Objective To investigate the protective effect and underlying mechanism of liraglutide on brain injury in lipopolysaccharide （LPS）-induced septic mice. Methods Ninety C57BL/6 mice were randomly divided into three groups （n = 30）： the Control group， the Sepsis group （LPS）， and the LPS + Liraglutide group （LPS + Lira）. The LPS and LPS + Lira groups received intraperitoneal injections of LPS （15 mg/kg）， while the Control group received an equal volume of normal saline. The LPS + Lira group was subcutaneously injected with liraglutide （200 µg/kg） twice daily for 3 consecutive days， starting 2 days before the LPS injection. Results Significant differences were observed among the three groups in terms of survival rate， brain water content， the number of normal pyramidal cells in the hippocampal CA1 region， apoptosis rate， oxidative stress markers， inflammatory cytokine levels， and related protein expression （P < 0.05）. Further pairwise comparisons showed that， compared to the Control group， the LPS group had a significantly reduced survival rate （P < 0.05）， increased brain water content （P < 0.05）， decreased number of normal pyramidal cells in the hippocampal CA1 region （P < 0.05）， and an elevated apoptosis rate （P < 0.05）. Additionally， oxidative stress and inflammatory cytokine levels were significantly higher （P < 0.05）， with increased expression of NLRP3， Casp1 p10， Caspase-3， and Bax proteins （P < 0.05）， and decreased expression of Bcl-2 （P < 0.05）. The LPS + Lira group showed significant improvement in all these indicators compared to the LPS group （P < 0.05）. Conclusion Liraglutide exerts a protective effect against LPS-induced septic brain injury by inhibiting the activation of the NLRP3/Caspase-1 signaling pathway， thereby reducing inflammation， oxidative stress， and apoptosis.

关键词

脓毒症 / 脑损伤 / 利拉鲁肽 / NLRP3炎性体

Key words

Sepsis / Brain injury / Liraglutide / NLRP3 Inflammasome

脓毒症是一种由感染引起的全身性炎症反应综合征，可能导致脑、心、肝、肾等多器官功能障碍，具有高发病率和高死亡率的特点。脓毒症早期常伴随大脑功能障碍^[1]，出现意识模糊、昏迷等症状^[2]，称为脓毒症相关脑病（sepsis-associated encephalopathy, SAE）。SAE的发生导致病情进一步恶化，严重影响患者预后和生活质量，甚至增加死亡风险^[3]。既往研究显示SAE发病机制复杂^[4]，而过度的炎症反应和氧化应激在其发生和发展中均起关键作用^[5]，最终导致细胞凋亡。研究显示胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide 1, GLP-1）作为一种肠内分泌激素，不仅能调节血糖平衡和能量稳态^[6]，还具备抗炎、抗氧化和神经保护等作用^[7]，可能为SAE的治疗提供新思路。

利拉鲁肽属长效GLP-1类似物，它不仅广泛应用于2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）的治疗，还对脑出血、创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）、阿尔茨海默氏病（Alzheimer's disease, AD）等多种神经系统疾病具有保护作用^[8]。这些神经系统疾病的共同病理特征是过度的炎症反应、氧化应激和细胞凋亡，与SAE的病理机制相似。同时NEVES等^[9]通过对小鼠皮下注射利拉鲁肽，发现其认知功能障碍得到明显改善。因此，推测利拉鲁肽可能在SAE中发挥保护作用，但其机制仍不明确，尚需进一步开展相关研究。

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3）炎性小体是由NLRP3、衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC）和半胱天冬酶前体-1（procaspase-1） 组成的多蛋白复合物。研究表明，NLRP3炎性小体可激活caspase-1表达，促进炎性细胞因子前体白介素-1β（interleukin-1β, IL-1β） 和白介素-18（interleukin-18, IL-18）的成熟和分泌^[10]；同时，调控caspase-1依赖性的炎性细胞死亡，导致细胞在炎性和应激条件下死亡^[11]。抑制NLRP3炎性小体可保护AD、TBI、缺氧缺血性脑损伤和蛛网膜下腔出血等神经系统疾病。有研究提示，NLRP3在SAE的病理生理过程中发挥有害作用，促进炎症反应和神经细胞凋亡^[12]。此外，在脂多糖（lipolyaccharide, LPS）诱导的急性肺损伤和非酒精性脂肪肝中，利拉鲁肽可下调NLRP3炎性小体的表达，减少炎性损伤^[13-14]。

因此，本研究旨在评估利拉鲁肽对SAE的保护作用，并探讨其是否通过抑制NLRP3炎性小体信号通路，发挥抗炎、抗氧化应激及抗凋亡作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠（8 ~ 12 周） ，购自成都达硕实验动物有限公司（许可证编号：SYXK川2018-065），在标准环境下饲养。本研究经西南医科大学伦理委员会批准（批号：20211122-012）。

1.1.2 模型制备

将90只小鼠按随机数字表法分为3组，每组30只。对照组（Control）：腹腔注射生理盐水；脓毒症组（LPS）：腹腔注射LPS（15 mg/kg）；脓毒症 + 利拉鲁肽组（LPS + Lira）：在LPS注射前2天开始皮下注射利拉鲁肽（200 μg/kg），每日2次，连续3 d，随后腹腔注射LPS（15 mg/kg）。脓毒症小鼠建模成功标准：小鼠表现出精神萎靡、呼吸急促及活动减少的症状。

1.1.3 实验试剂

细胞凋亡检测采用TUNEL试剂盒（罗式，瑞士）。免疫荧光染色及Western blot采用NLRP3抗体（Novus Biologicals，美国），Casp1 p10抗体（Santa Cruz，美国），caspase 3和Beta action抗体（武汉三鹰，中国），Bax抗体（Cell Signaling，美国），Bcl-2抗体（Abcam，美国）。炎症因子检测采用ELISA试剂盒（碧云天，中国）。

1.1.4 灌注和取材

LPS注射24 h后，小鼠经戊巴比妥钠麻醉并摘眼球取血，离心后冻存血清。取血后，用生理盐水灌注小鼠。取大脑后擦干血渍称重，用于检测脑含水量；右侧半脑石蜡包埋用于HE染色；左侧半脑切冰冻切片用于免疫荧光剂TUNEL染色；海马组织冻存于-80 ℃，用于Western blot和ELISA分析。

1.2 检测指标与方法

1.2.1 生存率

记录每组12只小鼠建模后7 d的生存情况，计算7 d生存率。生存率 = 生存到7 d的小鼠数/12 × 100%。

1.2.2 海马组织病理改变

LPS注射24 h后，小鼠被处死，经主动脉灌注生理盐水和10%福尔马林。取出大脑固定于10%福尔马林，脱水、包埋、切片，进行HE染色。在200倍显微镜下观察海马组织病理变化。

1.2.3 脑含水量

采用干-湿重法测定脑含水量：造模24 h后麻醉取脑，称重并记录湿重，65 ℃烘烤48 h至恒定后记录干重。计算公式：脑含水量 = [(湿重 - 干重） / 湿重] × 100%。

1.2.4 细胞凋亡率

左侧半脑切片（厚度8 µm），用4%多聚甲醛固定30 min，0.2% Triton X-100通透15 min。TUNEL反应液在37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗后，DAPI染色细胞核5 min。在200倍荧光显微镜下观察海马CA1区，统计TUNEL阳性细胞数和总细胞数，计算细胞凋亡率 = TUNEL阳性细胞数/总细胞数 × 100%。

1.2.5 海马组织蛋白表达

采用Western blot法检测小鼠海马组织中的NLRP3, Casp1 p10，Caspase-3, Bax 和 Bcl-2蛋白表达情况。海马组织样本在RIPA裂解液中匀浆后，用Enhanced BCA Protein Assay Kit定量蛋白。蛋白样本变性后进行SDS-PAGE电泳并转膜，5%脱脂奶封闭1 h，4 ℃下与NLRP3、Casp1 p10、caspase 3、Bax、Bcl-2、Beta action抗体孵育过夜。TBST洗涤后，二抗室温孵育1 h。使用化学发光成像系统捕获蛋白印迹，并用ImageJ软件定量分析，将对照组蛋白表达水平标准化为1。

1.2.6 免疫荧光染色

冰冻切片固定和通透后，BSA封闭1 h，4 °C下与NLRP3和cleaved-caspase-1抗体孵育过夜。PBS洗涤后，与FITC标记的二抗室温孵育1 h。DAPI染色细胞核5 min，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下拍摄图像并用ImageJ分析荧光强度。

1.2.7 氧化应激

使用SOD试剂盒和MDA试剂盒 ，分别测定血清与海马组织中的SOD活性及MDA含量，按照试剂盒说明书操作。

1.2.8 炎性因子

采用ELISA试剂盒检测海马及血清中的肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α），白介素6（interleukin-6, IL-6）、IL-1β、IL-18。

1.3 统计学分析

所有数据使用SPSS 23.0软件分析。用Kaplan–Meier法分析小鼠生存率，组间差异采用Log-rank test进行比较；计量资料使用均数 ± 标准差（ \overline{x} ± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间两两比较采用LSD检验法。P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 生存率

Control组7 d生存率为100%，LPS组7 d生存率为16.7%，LPS + Lira组7 d生存率为50%，3组间小鼠生存率差异具有统计学意义（χ² = 18.95, P < 0.01）。进一步两两比较显示，LPS组与Control组，LPS + Lira组与LPS组间的差异均有统计学意义（P < 0.05，图1A）。

2.2 脑含水量

Control组小鼠脑含水量为（76.45 ± 0.87）%，LPS组脑含水量为（78.53 ± 0.70）%，LPS + Lira组脑含水量为（76.88 ± 0.83）%，3组间小鼠脑含水量差异具有统计学意义（F = 11.21，P < 0.01）。进一步两两比较显示，LPS组与Control组，LPS + Lira组与LPS组间的差异均具有统计学意义（P < 0.01，图1B）。

2.3 海马组织病理变化

3组小鼠海马CA1区每平方毫米的正常锥体细胞数间差异具有统计学意义（F = 13.41, P < 0.05）。Control组小鼠海马CA1区细胞排列整齐，分布均匀，结构完整，正常锥体细胞数为（508.2 ± 65.5）个；LPS组细胞排列紊乱，形态不规则，出现细胞丢失、溶解、胞浆深染、胞核固缩等病变，正常细胞数量为（203.7 ± 122.5）个；LPS + Lira组小鼠的病理变化较LPS组有所恢复，正常细胞数为（390.5 ± 111.1）个（图1C、图1D）。

2.4 细胞凋亡率

Control组小鼠海马细胞凋亡率为（1.18 ± 0.74）%，LPS组细胞凋亡率为（15.52 ± 4.99）%，LPS + Lira组细胞凋亡率为（6.38 ± 3.84）%，3组小鼠细胞凋亡率比较差异具有统计学意义（F = 23.57, P < 0.05）；进一步两两分析显示，LPS组与Control组，LPS + Lira组与LPS组间的细胞凋亡率差异均具有统计学意义（P < 0.05，图1E、图1F）。

2.5 相关蛋白Western blot 结果

3组相关蛋白表达水平间差异均具有统计学意义（P < 0.05）。进一步两两比较显示，与Control组相比，LPS组NLRP3、Casp1 p10、Caspase-3、Bax蛋白表达水平均显著上调（P < 0.01，图2A - 图2E），而Bcl-2蛋白表达水平降低（P < 0.05，图2A、图2F）。LPS + Lira组与Control组相比，NLRP3、Casp1 p10、Caspase-3、Bax蛋白表达间差异均无统计学意义（P > 0.05）。与LPS组相比，LPS + Lira组NLRP3、Casp1 p10、Caspase-3、Bax蛋白表达水平均下调，Bcl-2蛋白表达水平上调（P < 0.05，图2A - 图2F）。

2.6 免疫荧光染色结果

免疫荧光结果见图3A、图3C。定量分析结果显示，与Control组相比，LPS组与LPS + Lira组小鼠海马组织中NLRP3以及Casp1 p10的表达均显著增加（P < 0.05，图3B、图3D）。与LPS组相比，LPS + Lira组中NLRP3和Casp1 p10的表达均降低（P < 0.01，图3B、图3D）。

2.7 氧化应激

与Control组相比，LPS组海马及血清中SOD活性降低（P < 0.01，图4A、图4C）而MDA含量增高（P < 0.01，图4B、图4D）；与LPS组相比，LPS + Lira组中SOD活性增加(P < 0.05，图4A、图4C）而MDA含量下降（P < 0.01，图4B、图4D）。

2.8 炎症因子

与Control组比较，LPS组和LPS + Lira组小鼠的血清及海马中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18的含量均升高(P < 0.05，图5）；与LPS组比较，LPS + Lira组中的IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18的含量均下调(P < 0.05，图5）。

3 讨论

本研究发现，利拉鲁肽显著提高了脓毒症小鼠的生存率，改善了海马组织病理损伤，抑制了细胞凋亡，减轻了脑水肿。表明利拉鲁肽对LPS诱导的脓毒症脑损伤具有保护作用。

脓毒症是一种全身性炎症反应，炎症介质可以直接或间接进入脑实质，诱发氧化应激、线粒体功能障碍和小胶质细胞活化，导致神经病理异常。TNF-α和IL-6是脓毒症中的主要炎症因子，能够加重炎症，增加脑水肿，并促进神经元凋亡^[15-17]。本研究显示，LPS处理后海马和血清中这些炎症因子显著增高，而利拉鲁肽能减少炎症因子的表达，表明其能抑制LPS诱导的炎症反应。此外，氧化应激是引起脓毒症脑损伤的重要因素^[18]。利拉鲁肽通过减少海马和血清中MDA表达，提高了SOD活性，展现了减轻氧化应激的脑保护作用。利拉鲁肽还降低了促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的水平，提高了抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，进一步表明其能通过抑制细胞凋亡保护脑组织^[19-20]。

NLRP3是NLRs家族中的重要成员，被激活后可形成NLRP3炎性小体复合物 (NLRP3，ASC，pro-caspase-1） ，最终激活caspase-1，促使炎症因子pro-IL-1β及pro-IL-18裂解与分泌^[9]。NLRP3炎性小体参与了多种神经炎症性疾病的发生发展。ISMAEL等发现，NLRP3抑制剂MCC950可有效减轻TBI后的脑水肿，抑制炎症因子IL-1β与TNF-α的表达，并显著抑制Caspase-3和cleaved PARP的表达，通过抗炎和抗凋亡途径减轻TBI损伤^[21]。ZHU等^[22]发现，NLRP3炎性体抑制剂Ac-YVAD-CMK可改善LPS诱导的长期抑郁样行为和记忆力减退。LPS通过Toll样受体4介导激活NLRP3通路，诱发IL-1β的表达^[23]。在本研究中，LPS注射后海马中NLRP3以及cleaved caspase-1的表达显著增加，表明NLRP3炎性体参与了脓毒症脑损伤的进展。利拉鲁肽表现出抗炎和抗氧化应激的作用，在LPS诱导的急性肺损伤模型中，利拉鲁肽也可抑制NLRP3炎性小体的高表达^[24]。在本研究中，利拉鲁肽处理抑制了脓毒症小鼠海马中NLRP3以及caspase-1 p10 的表达。ELISA结果显示，利拉鲁肽还抑制了LPS引起的IL-1β与IL-18的表达增加，进一步证明了其对NLRP3/Caspase-1通路的抑制作用。

此外，LPS诱导的Caspase-3在海马中的表达增加，而利拉鲁肽抑制了Caspase-3的表达，这可能与其抑制NLRP3炎性小体产生的作用有关。NLRP3炎性小体还可通过ASC寡聚化激活caspase-1，诱发细胞焦亡^[25]。利拉鲁肽的脑保护作用可能也与抑制NLRP3炎性体进而抑制细胞焦亡有关。

4 结论

利拉鲁肽通过抑制NLRP3/Caspase-1信号通路激活，减轻炎症反应、氧化应激及细胞凋亡，从而对脓毒症小鼠脑损伤产生保护作用，这一研究结果可能为利拉鲁肽的临床应用提供新的理论依据。

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基金资助

国家自然科学基金(81873930)

四川省科技计划项目(2022YFS0615)

泸州市科技计划项目(2023SYF099)