关节软骨的损伤难以延缓或逆转，随着全球人口老龄化趋势的加剧，软骨损伤发病率逐年上升，已成为全球范围内日益严峻的公共卫生问题
[1]。目前的治疗手段均以缓解症状为主，如康复训练、药物治疗以及外科治疗等，但是这些治疗手段尚无法有效修复软骨，这是本领域面临的巨大挑战和困难
[2]。生物治疗有望改善这一现状，但开展软骨生物研究的重要前提是建立一个真实模拟软骨结构的疾病研究模型，目前的模型系统主要依赖于单层细胞培养，但是与天然3D组织相比，它们在基因表达、表观遗传学和细胞功能方面往往存在显著差异。此外，它们通常缺乏细胞-细胞和细胞-基质的相互作用，而软骨细胞在体外增殖培养时往往会呈现纤维化的表现
[3]。这些局限性为基于细胞的体外3D模型的发展提供了动力。代表重大技术突破的类器官已经成为一种新的模型系统，类器官是指由干细胞或器官特异性祖细胞分化增殖的三维多细胞组织，这些类器官在模拟器官的微环境、细胞类型和细胞间相互作用方面展现出了很高的相似度
[4-5]。通过构建软骨类器官不仅可以模拟人体软骨的结构和功能，还能为软骨损伤的修复和再生提供潜在的解决方案。同时，软骨类器官还可以用于构建软骨疾病的体外模型，帮助深入理解疾病的发生机制，并为新药筛选和治疗方案评估提供有效平台。尽管软骨类器官在研究领域中具有广阔的前景，但其应用仍面临多方面挑战。软骨类器官的构建中如何在三维培养环境中精确控制细胞排列、层次结构和组织形态仍是一个困难问题，而现有的生物材料可能难以完美模仿软骨独特的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）成分和结构，此外如何在临床研究中实现大规模类器官构建和应用仍是巨大挑战。本文旨在回顾和总结现有的研究成果和技术进展，探讨软骨类器官作为疾病模型和治疗工具的优势、局限及未来发展趋势，为进一步推动软骨疾病研究及临床转化提供理论参考。
1 类器官的起源与发展
类器官概念的提出最早可追溯到20世纪初，当时的研究已经观察到某些类型的细胞如干细胞，在体外环境中表现出除增殖以外的能在特定条件下自发形成类组织结构的能力，但这些自组织能力主要体现在单一细胞群体的聚集和分化上。2009年荷兰的HANS CLEVERS团队
[6]通过研究小肠组织中的Lgr5
+干细胞，首次实现了小肠类器官的构建，这一发现标志着类器官技术的正式诞生。通过特定的培养基和生长因子的组合，干细胞在特殊的三维环境中不仅分化成不同类型的细胞成分，而且能够自组织成具有类似来源器官形态和功能的三维结构。随后类器官技术进入快速发展的时期，2015年，通过小鼠肝脏Lgr5
+干细胞在体外和体内分化为功能性肝细胞并实现长期扩增，构建出肝脏类器官
[7]。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）为类器官模型提供了强大的种子细胞来源，iPSCs是通过重编程成体细胞获得的，可以在体外增殖并分化成三胚层的各种细胞类型，通过iPSCs已经成功构建了大脑类器官、心脏类器官、肝脏类器官、肾脏类器官等
[8-10]。新发现的其他来源的干祖细胞不断丰富类器官的种子细胞选择，2019年WANG等
[11]通过单细胞测序技术，在小鼠胰腺中发现了一种新的蛋白C受体 (protein C receptor, PROCR ) 阳性祖细胞，通过诱导分化能产生所有4种内分泌细胞类型，构建出具有葡萄糖反应性和胰岛素分泌功能的胰腺类器官。目前已构建的类器官除了上述组织来源外，还包括视网膜、乳腺、泪腺、耳蜗、肺脏、甲状腺、皮肤、牙釉质和骨髓等各个组织器官来源的类器官
[12-20]。由于组织器官的复杂性，类器官尚不能完全再现出来源器官的全部功能和空间结构，但随着干细胞分化技术、三维培养技术、基因编辑技术和材料科学的发展，类器官技术正在朝向更加复杂的结构、血管化和免疫化的方向发展，并出现整块组织培养类器官技术
[21-22]。相较于其他系统的类器官发展，骨/软骨类器官的构建仍处于起步阶段。相比较上皮类器官，软骨组织的细胞在体外培养中的增殖能力较差，通常更依赖于合适的微环境（如支持细胞、细胞外基质）来维持其特性，因此在培养体系的构建上也具有更多的挑战。而软骨特殊的ECM和力学环境也使得软骨类器官的构建和优化变得更为复杂。
2 软骨类器官的构建
虽然组织工程技术在骨与软骨研究中应用广泛，软骨类器官技术与组织工程技术也有一定的交叉，但同时也具有差异性。软骨类器官的构建需要合适的种子细胞来源，使用含有促进其增殖和定向分化的特定因子，在3D培养介质的环境下，具有干性的细胞通过自组织和相互作用形成具有软骨结构的类器官组织，其培养过程中更多侧重于模拟软骨发育的自然过程。
2.1 构建软骨类器官的种子细胞
种子细胞是软骨类器官构建的基础，其来源直接影响类器官的形成与功能。理想的种子细胞应具有较强的增殖潜力和定向的软骨方向分化能力。软骨类器官需要具有与天然软骨组织相似的细胞组成和分层排列，理论上软骨类器官应当模拟软骨组织具有的区域依赖性特征的表层、中间层和深层结构，并具备特异性的ECM代谢特征和基因表达。
间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）因其较强的自我更新能力、较低的免疫原性及多向分化潜力，成为了再生医学、组织工程以及类器官研究中备受关注的细胞来源之一。骨髓来源的间充质干细胞( bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs )具有很强的三系分化能力，在体外通过定向诱导可分化成骨、软骨和脂肪组织。但是MSCs作为成体干细胞来源，异质性较大，不同来源或不同培养条件下，MSCs的分化潜力可能存在较大差异。此外MSCs在培养过程中会发生表型的改变，可能导致软骨分化的不足，导致软骨肥大化或纤维化
[23-24]。BM-MSCs构建的软骨类器官在某些方面仍存在成熟度不足的问题。虽然这些类器官能够生成软骨样基质并表现出软骨细胞特征，但与自然软骨相比，它们的成熟度、力学性能、耐压性和长期稳定性仍然存在差距
[25]，导致其临床应用仍存在一定的限制。通过进一步探索MSCs在软骨类器官构建中的机制、优化材料学和力学调控条件，有望推动MSCs在这一领域的广泛应用。苏佳灿团队将光聚合和自组装技术结合，通过微流控系统开发的水凝胶微球（responsive swelling-degradation hydrogel microspheres，RSD-MS）可增强BMSCs的增殖与软骨定向分化，从而为构建和长期培养软骨类器官提供了一种的新策略
[26-27]。
iPSCs是一种在体外通过重新编程常规体细胞，使其重新获得类似胚胎干细胞特性的干细胞类型。2006年，TAKAHASHI等
[28]通过引入4个关键转录因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc），将体细胞转化为具有多能分化特性的iPSCs。该发现具有重大意义，提供了无须胚胎来源的替代方案，同时具备与胚胎干细胞相似的多能性，能够分化成体内几乎所有类型的细胞，近年来广泛应用于软骨类器官的构建。O’CONNOR等
[29]将小鼠iPSCs按照不同的时间顺序分别通过成软骨和和成骨细胞因子的诱导，得到一个软骨区域和一个钙化的成骨区域，实现从单细胞生长为具备特定功能的类器官。ABE等
[30]使用同种异体iPSCs来源的软骨类器官在膝关节软骨缺损的灵长类动物模型中存活并整合，并被重塑为关节软骨，这标志iPSCs在软骨类器官的应用取得重大突破。软骨类器官还可以使用其他来源的干细胞进行构建，比如通过琼脂糖系统培养，制备滑膜间充质细胞来源的软骨类器官，用于模拟关节疾病的进展
[31]。通过细胞响应性水凝胶促进脂肪干细胞自发和连续增殖和聚集，用于体外构建软骨微组织，表现出与天然透明软骨极其相似的组织学特征和生物力学性能
[32]。
2.2 构建软骨类器官的细胞因子
各种细胞因子不仅调节细胞的分化方向，还控制细胞的增殖、迁移与组装，通过与细胞表面受体结合，激活引导细胞命运和发育的信号通路促进软骨类器官的形成
[33-34]。TGF-β1、TGF-β3和BMP2等因子是软骨分化中最关键的调控因子之一。它们通过激活Smad信号通路，促进多能干细胞（如 iPSCs等）向软骨样细胞的分化。TGF-β家族成员特别是TGF-β1在软骨分化过程中扮演着中心角色，研究表明，TGF-β1能够促进软骨样基质（如聚集蛋白和糖胺聚糖）的沉积，同时抑制软骨细胞的去分化
[35]。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMP）家族尤其是BMP-2可促进多能干细胞向软骨样细胞的分化，且能够增强细胞间的黏附作用，促进软骨基质的合成
[36]。成纤维生长因子（fibroblast growth factor, FGF）对软骨生成也有一定的作用，FGF-2不仅促进软骨样细胞的增殖，也能增强软骨基质的合成，并协助BMP、TGF-β的信号通路，从而加强软骨组织的发育
[37]。此外地塞米松、胰岛素-转铁蛋白-硒（insulin-transferrin-selenium, ITS-G）、L-脯氨酸、抗坏血酸、L-谷氨酰胺等诱导剂和补充剂等均为软骨诱导培养方案的重要成分
[38-39]。细胞因子的使用通常遵循阶段诱导原则，即不同时期应用特定的细胞因子诱导干细胞呈现不同的分化阶段，模拟体内软骨细胞的发育进程
[40]。这种控制对于实现功能所必需的正确细胞类型和组织结构至关重要。软骨类器官的形成不仅仅依赖于细胞因子的作用，还依赖于三维培养环境。在三维培养基质中，细胞因子能够促进细胞的定向分化，并增强细胞与细胞之间以及细胞与基质之间的相互作用，从而促进类器官的形成和稳定。
2.3 构建软骨类器官的三维培养材料
三维培养系统是软骨类器官成功构建的核心。软骨发育具有一定时空特性，在类器官发育过程中涉及复杂的微环境信号和化学诱导过程。良好的生物材料可以定期向细胞输送生长因子和细胞因子，同时提供物理支撑，还能够模拟软骨的力学性质，影响细胞的黏附、增殖与分化并使软骨类器官的形态更接近天然软骨组织。常用的培养材料包括各种类型的水凝胶、基质胶、海藻酸盐、琼脂糖等。基质胶是从小鼠肿瘤中提取的细胞外基质成分，含有多种胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白等
[41]。它能够提供一个接近自然软骨微环境的基质，促进细胞的附着、增殖和分化。基质胶具有较高的生物相容性，能为细胞提供合适的支持结构，并且有助于细胞在三维空间中形成类器官结构。但其成分复杂，批间差异大以及昂贵的价格限制了其应用
[42-44]。水凝胶具有高度的水合性质、与各种天然材料的可融合性以及良好的生物相容性，使其广泛用于软骨类器官的构建。KLEUSKENS等
[45]将来自骨关节炎（osteoarthritis, OA）和非退变组织的人软骨细胞通过胶原水凝胶自组装成含有Ⅱ型胶原蛋白（collagen 2，COL2）和蛋白聚糖的软骨类器官，然后将类器官封装在黏弹性海藻酸盐水凝胶中以形成更大的组织。将滑膜间充质干细胞（synovial mesenchymal stem cells, SMSC）通过琼脂糖微孔培养和软骨分化，可生成SMSC来源的软骨类器官
[31]。未来构建软骨类器官的材料发展方向主要集中在提高材料的生物相容性、机械性能、可调节性以及促进细胞功能和组织修复的能力，如目前的智能响应型水凝胶、纳米技术、生物打印技术与生物墨水等的应用，将会进一步提升软骨类器官的生物学效能，促进软骨的再生。
通常根据是否需要三维支架材料将软骨类器官的构建方式分为支架构建和无支架构建法，前者的应用范围更为广泛。无支架法不使用外部支架进行类器官构建，主要依赖细胞自身的聚集和自我组织能力，该法通常涉及使用高密度的细胞种植，通过悬浮培养的方法形成类器官。MIZUNO等
[46]从小牛不同的纵深区的关节软骨中分离出软骨细胞，成功地构建了一个具有自我组织能力的软骨细胞球形类器官模型，能够模拟关节软骨在不同深度区的细胞行为和细胞外基质的分布。这一模型不仅能够有效地模拟软骨的生理特征，还为研究软骨的发育、病理以及软骨再生提供了新的工具。HUO
[47]提出了一种新的软骨类器官生物组装 （cartilage organoid biological assembly, COBA）策略，以实现无支架的 3D 软骨再生，主要涉及细胞悬浮培养、细胞聚集和球状体形成三个方面并证明类器官形成过程依赖于高密度细胞聚集所形成的低氧微环境介导的糖酵解代谢重编程，保持了软骨表型，并促进了软骨特异性ECM沉积。支架法依靠上面提到的各种外部支架材料来提供物理支持，并通过调节支架材料的化学、物理性质来促进软骨样细胞的附着、增殖、分化和最终形成类软骨组织。支架通常是三维网络结构，可以是天然的或合成的，能够模拟体内软骨的微环境。支架材料一般具有良好的生物相容性、可降解性和适当的机械强度。该方法的核心是通过合适的材料和构建方法，使细胞在三维空间中形成类软骨组织，并通过ECM的合成，最终实现软骨组织的再生和修复。
3 软骨类器官的应用
3.1 药物筛选平台
相对于动物实验，应用类器官进行药物测试的明显优势是能够实现药物的高通量筛选。ABRAHAM等
[48]开发了人源体自组装骨骼类器官系统，类器官的软骨部分和骨部分会发生极化，类似于原生骨骼组织中的分层结构。这种极化过程对于类器官的生物学特性至关重要，它保证了骨和软骨部分在类器官中的功能分化。在培养过程中，骨类器官表现出骨生成和微血管形成的能力，而软骨类器官则表现出软骨发育和成熟的迹象。通过IL-1β处理类器官建立骨关节炎疾病模型，并验证了A2腺苷受体（adenosine receptors, AR）激动剂对损伤性炎症的保护作用，实验结果表明A2AR激动剂通过上调细胞内
FOXO1和
FOXO3基因来拮抗炎症和抑制软骨降解酶，这表明类器官能够有效地模拟炎症反应，为药物测试提供了可靠的生物学平台。在体外和体内定向分化干细胞向软骨生成的过程往往会面临软骨细胞肥大倾向，为了解决这一问题，白晓春团队利用携带COL2A1-mCherry和COL10A1-eGFP双重报告基因的人类扩展型多能干细胞（human expanded pluripotent stem cells, hEPSCs）构建了软骨样类器官系统，该类器官呈现出类似于人体软骨的特征性分区，即肥大区、中间区和深部区3个区域，而它们的细胞外基质含量、结构和软骨细胞行为各有不同
[49]。该类器官系统能够实时监测软骨生成和肥大，在对2 040种美国食品和药物管理局批准的化合物进行药物筛选后，发现酚妥拉明作为α-肾上腺素受体（α-adrenergic receptors, α-AR）拮抗剂，在促进软骨细胞分化和防止肥厚分化方面具有双重功能。在机制上，α2-AR信号通过环磷酸鸟苷依赖的分泌型白细胞蛋白酶抑制因子（secretory leukocyte protease inhibitor, SLPI）诱导肥大和退变。删除
SLPI基因的软骨类器官则可减轻退变和肥大，有助于大面积软骨缺损的修复。最终，靶向α2-AR/SLPI是一种有前景且临床可行的策略，通过促进软骨生成并抑制肥大来实现软骨再生。
3.2 疾病模型构建
与传统的2D细胞培养相比，软骨类器官更能模拟软骨组织的复杂结构和生理反应
[50]。使用软骨类器官构建的疾病模型还可以减少对动物实验的依赖。软骨类器官可以利用患者来源的干细胞进行定制化构建，从而为个性化医疗提供了可能。软骨类器官系统允许在一个平台上同时进行多个实验，并且可以精准控制环境条件（如氧气浓度、营养供应、机械刺激等）。这对于疾病机制的研究和药物筛选尤其重要，因为不同条件下，细胞和组织的反应可能会有所不同，软骨类器官能够模拟这些变化，从而提高试验结果的可信度。MIZUNO等
[46]构建了具有自我组织能力的软骨细胞球形类器官模型，能够模拟关节软骨在不同深度区的细胞行为和细胞外基质的分布。这一模型不仅能够有效地模拟软骨的生理特征，对于深入理解骨关节炎的发病亦具有重要价值。SUN等
[31]研究表明由SMSC建立的软骨类器官可以影响miR -138 / FOXC1 / HIF轴，从而调节软骨形成和骨关节炎进展。作者于2024年的研究中再次证明衰老标志物miR-24与骨关节炎患者的软骨损伤呈负相关。骨关节炎软骨缺损患者表现出关节软骨细胞衰老的上调。衰老标志物miR-24与骨关节炎患者软骨损伤呈负相关。miR-24通过靶向TAOK1减缓软骨细胞衰老，并促进软骨生成，作用于SMSC类器官。衰老靶向的miR-24微球/SMSC类器官复合水凝胶（miR-24 microspheres/SMSC organoid composite hydrogel, MSOH）能够通过增强miR-24/TAOK1信号通路成功修复骨关节炎微环境中的软骨缺损，提示MSOH可能成为骨关节炎患者软骨修复的新型治疗策略
[51]。VAN等
[52]构建了FN1突变的iPSCs来源的软骨类器官，研究表明纤维连接蛋白中胶原蛋白结合域的突变导致其与COL2的结合能力显著降低，进一步分析表明突变的纤维连接蛋白影响了软骨生成能力，并倾向于导致促代谢的骨关节炎状态。
3.3 修复与再生医学
软骨损伤，尤其是关节软骨损伤，因软骨组织血供差，通常很难自我修复，骨的修复能力虽然显著地强于软骨，但当骨缺损的大小超过骨组织固有的临界修复尺寸时，愈合过程受阻并可能导致骨不连的形成，需要采用自体或同种异体骨移植等方法治疗骨缺损
[53]。软骨类器官的出现使得体外重建骨及软骨组织成为可能。通过体外培养和定向诱导，有望生成较大面积的软骨类器官，这些类器官可能成为骨及软骨移植的理想选择。在未来，软骨类器官或能为那些遭受严重骨/软骨损伤的患者提供自体或异体的移植材料，从而有效地修复骨与关节损伤。在关节修复方面，ABE等
[30]利用食蟹猴iPS细胞（cyiPSCs）分化为软骨细胞，制备cyiPSC来源的软骨类器官(cyiPS-Cart)。这种cyiPS-Cart 直径为1 ~ 3 mm，ECM经番红O染色呈阳性，免疫组化分析显示ECM中含有COL2，COL1除在颗粒边缘外均未检测到。然后将cyiPS-Cart以同种异体的方式移植到食蟹猴膝关节表面的软骨缺损处。研究结果表明同种异体iPSCs软骨类器官在膝关节软骨缺损的灵长类动物模型中存活并整合，且被重塑为关节软骨。组织学分析显示，同种异体移植至软骨缺损模型的cyiPS-Cart在4个月内未引起宿主免疫反应，且可以促进组织修复，还可以与宿主原生关节软骨融合，阻止周围软骨进一步退化。单细胞测序分析表明，cyiPS-Cart在移植后分化且激活了对关节润滑至关重要的基因
PRG4，通路分析提示SIK3失活参与了这个过程。该研究充分展示了软骨类器官在免疫耐受性和组织修复方面的潜力，可能成为治疗关节软骨缺损和退行性疾病的新策略。在骨修复方面，骨痂类器官可模拟软骨内成骨，使得干细胞在骨缺损部位聚集和分化形成类骨痂样的软骨核心并完成随后的成骨分化。欧阳宏伟团队
[54]通过数字光处理（digital light processing, DLP）打印技术，基于目前已经建立的DLP-3D打印技术平台成功打印出含有hBMSCs的GelMA水凝胶微球，且该微球能够在体外长期培养并保持良好的细胞活性和细胞伸展性，在软骨诱导培养基中诱导分化3周后，构建出与发育过程中相似的骨痂类器官，且具有与发育中软骨内成骨相似的细胞构成，并实现了4 周内快速原位骨再生。TAM等
[41]利用hiPSCs进行诱导定向分化为中胚层谱系，并进一步分化为软骨细胞，这些软骨细胞随后自组装成软骨类器官。所获得的软骨细胞在Ⅱ型胶原蛋白的表达水平上与原代人类关节软骨细胞相似，并且在体内异位移植后能生成稳定的软骨。在通过促生长刺激和用促炎介质预处理后，这些软骨类器官成功地连接了免疫缺陷小鼠的临界尺寸长骨缺损。随着技术的不断提高，软骨类器官有望在骨或软骨缺损等方面有更为丰富的应用。
3.4 类器官构建与多学科交叉融合
随着新兴技术的发展和与不同学科的交叉融合，软骨类器官的构建和应用有望进一步优化和提高。刘鹏团队
[55]利用单细胞测序技术，系统绘制了人类椎间盘的单细胞图谱，发现一种全新的PROCR
+人髓核祖细胞，具有成骨、成软骨和成脂三系分化能力，未来可能为构建椎间盘类器官奠定基础。此外，三维打印技术和生物墨水的引入也可能为软骨类器官的精确构建提供新思路
[56-57]。CRISPR/Cas9基因编辑技术可帮助构建疾病特异性的类器官模型，有助于个性化的疾病建模和特定药物筛选
[58]。随着微流控技术的发展，基于该技术的类器官芯片（Organ-on-a-chip）将为高通量药物测试等领域提供强大的实验平台
[59]。人体功能的正常实现通常需依赖不同组织和器官之间的相互协作，目前大多数类器官模型仅涵盖单一组织类型，在人体的骨关节系统中，神经、肌肉和骨骼间的互作尤为关键，向阳飞团队
[60]构建了首个自组织的人类神经肌肉骨骼类器官，为研究人类神经肌肉骨骼轴及相关疾病提供了人源体外模型。未来通过多学科的交叉合作，将会进一步加速软骨类器官的研究进展，并推动其在临床的应用。
4 小结与展望
软骨类器官的发展尚处于起步阶段，构建更加接近人体软骨解剖和完整功能的软骨类器官仍面临诸多挑战。但软骨类器官作为一种创新的生物模型，在再生医学和软骨修复等领域展现了巨大的潜力。随着相关技术的进步和深入研究，软骨类器官在未来将为治疗软骨缺损和退行性疾病提供新的希望，并推动组织工程领域的革命性进展。
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