甲瘤消颗粒提取工艺的优选及质量标准和安全性研究

Optimization of Extraction Process， Quality Standardization， and Safety Study of Jia Liuxiao Granules

摘要

目的 筛选与优化甲瘤消颗粒的提取工艺条件，并对其质量标准和安全性进行研究，为该制剂的开发提供理论依据。 方法 采取正交试验设计法，以阿魏酸、哈巴俄苷、羟基红花黄素A、橙皮苷得率和干膏得率为评价指标，主要考察3种因素，加水量、提取时间、提取次数对甲瘤消颗粒提取工艺的影响，最终筛选出最优提取工艺，同时对甲瘤消颗粒进行质量标准和安全性研究。 结果 甲瘤消颗粒最佳水提工艺为加12倍量水，提取2次，每次1 h；甲瘤消颗粒中的羟基红花黄素A含量测定无阴性干扰，液相色谱测定条件准确度高、分离度良好，可作为甲瘤消颗粒剂的含量测定指标；甲瘤消颗粒中柴胡、玄参、青皮和当归薄层色谱鉴别中各斑点显色清晰，分离效果较好，阴性无干扰，可作为甲瘤消颗粒中柴胡、玄参、青皮和当归的薄层鉴别方法；小鼠甲瘤消颗粒最大耐受剂量为84 g/kg，相当于临床人用量的140倍，表明甲瘤消颗粒安全性较高。 结论 优选的甲瘤消颗粒提取工艺稳定可行，安全性和质量标准研究的结果显示，能确保甲瘤消颗粒剂的安全性和质量稳定性。

Abstract

Objective To optimize the extraction process conditions for Jia Liuxiao Granules， and study their quality standards and safety to provide a basis for the development of this formulation. Methods Using the orthogonal experimental design method， we primarily investigated the effects of three factors—amount of water added， extraction time， and number of extractions—on the extraction process of Jia Liuxiao Granules， with ferulic acid， habuxin， hydroxy safflower yellow A， hesperidin， and dry extract yield as evaluation indicators. Finally， we screened out the optimal extraction process and conducted quality standards and safety studies on Jia LiuxiaoGranules. Results The optimal aqueous extraction process for Jia Liuxiao was to add 12 times the amount of water， extract twice， each time for 1 hour. The determination of hydroxysafflower A content in Jia Liuxiao granules had no negative interference， high accuracy and good separation under liquid chromatography conditions， and could be preliminarily used as a content determination indicator for Jia Liuxiao granules. In the thin layer chromatography identification of Chaihu， Xuanshen， Qingpi， and Danggui in Jia Liuxiao granules， each spot showed clear color， good separation effect， negative without interference， and could be used as a thin layer identification method for Chaihu， Xuanshen， Qingpi， and Danggui in Jia Liuxiao granules. The maximum tolerated dose of Jia Liuxiao granules in mice was 84 g/kg， which is equivalent to 140 times the clinical dosage for humans. This suggests that Jia Liuxiao granules have a relatively high safety margin. Conclusion The optimized extraction process is stable and feasible， and the study of safety and quality standards ensures the safety and stability of Jia Liuxiao granules.

Graphical abstract

关键词

正交设计 / 提取工艺 / 甲瘤消颗粒 / 质量标准研究 / 安全性评价

Key words

Orthogonal design / Extraction process / Jia Liuxiao granules / Quality standards / Safety evaluation

甲状腺结节（thyroid nodule，TN）临床发病率较高^[1-3]。全球患病率约为4% ~ 10%，我国约为32%，且随着年龄增长而升高，其中男性TN的患病率为26%，女性为39%，女性明显高于男性^[4]。近年来，TN的检出率逐年上升，可能与生活环境的变化、经济的增长、健康意识的提高以及医疗技术的进步等有关，对于一般人群，触诊对TN的检出率为3% ~ 7%^[5]，高频超声检出率达20% ~ 76% ^[6]。约10% ~ 15%结节会随着时间而增大^[7-8]，其中5% ~ 15%为恶性^[9]，良性甲状腺结节的患者中有7% ~ 14%存在恶性变的可能^[10]。尽管甲状腺癌总体发病率较小，但其发病率逐年增长，已经成为增长最快的恶性肿瘤^[11]，因此该病的早期治疗对于防治其癌变具有重要的临床意义。但手术治疗存在侵入性强、疗效不佳、副作用多、复发率高等问题^[14]。除手术外，并没有其他有效治疗良性TN的方法^[12-13]。研究发现中药治疗甲状腺结节优势明显^[15]。

甲瘤消丸为我院临床使用40年的院内制剂，疗效确切。甲瘤消丸由多种中药组成，各成分相辅相成，通过多种途径发挥治疗作用，具有综合治疗效果。甲瘤消方相关制剂的深入研究与开发应用可以解决临床上甲状腺结节无药可用的局面。本研究将其改良为颗粒剂，通过正交实验优化提取工艺，建立质量标准，并评估安全性，为甲瘤消颗粒的开发提供理论与实验依据。

1 材料和方法

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪（Waters Acquity Arc、HITACHI Chromaster），电子分析天平（ARA520，Ohaus Corp Pine Brook，NJ，USA），提取罐（G5，晖盛电器厂），电热套（MH-2000，北京科伟永兴仪器有限公司），电子分析天平MSX（SB EA，Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG 37070 Goettingen，Germany）；超声仪（KQ-800KDE，昆山市超声仪器有限公司）；水浴锅[HH-4，国华（常州）仪器制造有限公司]；电热板（DB-1 AB，天津工兴实验室仪器有限公司）。

1.2 试剂与试药

海藻，红花，玄参，莪术，当归，牡蛎，青皮，瓜蒌，柴胡均购自甘肃陇脉药材有限公司，药品生产许可证号：甘20160020，药品GMP证书：GS20170229；均符合《中国药典》2020年版规定；哈巴俄苷、阿魏酸、羟基红花黄素A和橙皮苷均购自上海麦克林有限公司（中国上海）；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、乙醇、甲苯和正己烷均为国产分析纯；甲瘤消颗粒由兰州大学第一医院提供（批号：20220301，20220302，20220303）。

1.3 实验动物

昆明（KM）小鼠（5 ~ 7周龄，体重18 ~ 20 g）40只，雌雄各半，SPF级，实验动物由兰州大学实验动物中心提供[生产许可证编号：SCXK（甘）2023 - 0003]，并遵循动物伦理要求，饲养于湿度40% ~ 60%，温度20 ℃ ~ 25 ℃的条件下。

1.4 方法

1.4.1 水提工艺优选

水提工艺单因素考察：水提工艺影响因素主要包括加水量、浸泡时间、提取时间、提取次数等，通过综合分析和比较，选取加水量、提取时间、提取次数作为主要因素。最佳水提工艺以提取时间选择（0.5 、1.0 、1.5）h，加水量选择（12、10、8）倍量，提取次数选择（1、2、3）次进行优化。以得膏率、羟基红花黄素A、阿魏酸、哈巴俄苷和橙皮苷得率为评价指标，考察因素为提取时间（A）、加水量（B）、提取次数（C），选用L9（34）正交设计试验，优选提取工艺；并进行3次重复验证试验。羟基红花黄素A（阿魏酸/哈巴俄苷/橙皮苷）得率 = 干膏羟基红花黄素A（阿魏酸/哈巴俄苷/橙皮苷含量）/原料羟基红花黄素A（阿魏酸/哈巴俄苷/橙皮苷含量）。

1.4.2 羟基红花黄素A、阿魏酸、哈巴俄苷和橙皮苷含量的测定方法

色谱：定量分析由Waters高效液相色谱仪完成。色谱条件：色谱柱为Waters C18 column（4.6 × 100 mm，2.7 μm），阿魏酸和羟基红花黄素A测定流动相：乙腈∶0.085%磷酸（17 : 83），流速为1 mL/min，柱温分别为35 ℃ 和25 ℃，进样体积为10 μL。哈巴俄苷测定流动相：乙腈∶0.085%磷酸（梯度洗脱，乙腈：0 ~ 15 min，5% ~ 10%；15 ~ 25 min，10% ~ 33%；25 ~ 30 min；33% ~ 50%；30 ~ 35 min，50% ~ 80%；35 ~ 40 min，80%；40 ~ 42 min，80% ~ 5%；42 ~ 45 min，5%），进样体积为10 μL，流速为1 mL/min。橙皮苷测定流动相：甲醇∶水（25 ∶ 75），流速为1 mL/min，柱温为35 ℃，进样体积为10 μL。阿魏酸检测波长236 nm。羟基红花黄色素A检测波长403 nm。哈巴俄苷检测波长210 nm。橙皮苷检测波长284 nm。

对照品溶液配置 阿魏酸：精密称取10.55 mg阿魏酸，加甲醇溶解并定容到50 mL，得储备液；羟基红花黄色素A：精密称取10.00 mg羟基红花黄色素A，加甲醇溶解并定容到50 mL，得储备液；哈巴俄苷：精密称取10.22 mg哈巴俄苷，加甲醇溶解并定容到50 mL，得储备液；橙皮苷：精密称取10.04 mg橙皮苷，加甲醇溶解并定容到50 mL，得储备液。分别精密量取阿魏酸、羟基红花黄色素A、哈巴俄苷和橙皮苷储备液1 mL至10 mL到容量瓶中，加甲醇至刻度即得标准品工作液。

供试品溶液配置 阿魏酸测定样品制备：称取约0.5 g水提物干膏（过四号筛）4份，精密称定，分别加入甲醇、70%甲醇、50%甲醇和25%甲醇 50 mL，精密称定，超声（800W）处理30 min，分别加入甲醇、70%甲醇、50%甲醇和25%甲醇补足重量，吸取溶液，0.2 μm的滤膜滤过，取续滤液上样；分别测定阿魏酸、羟基红花黄色素A、哈巴俄苷和橙皮苷的含量。

阴性对照样品溶液的制备 按处方比例称取各味药材（分别不含当归/红花/玄参/青皮），按制剂优选的提取方法提取，称取干膏适量，按“供试品溶液配置”方法配置阴性对照样品溶液。

1.4.3 羟基红花黄色素A测定方法学评价

标准曲线的制备：取对照品储备液梯度稀释为（3.125、6.250、12.500、25.000、50.000、100.000、200.000）μg/mL测定。理论板数：取10 μL对照品溶液进高效液相色谱仪分析，按羟基红花黄色素A峰的保留时间t_R和半高峰宽（W_h/2），并按n = 5.54（t_R/W_h/2）²计算色谱柱的理论板数。精密度试验：取对照品储备溶液，稀释至20 μg/mL，测定6次；稳定性评价：取供试品溶液分别于（0、2、4、8、12、24） h测定；重复性评价：称取干膏6份，精密称定，制备成供试品溶液，测定；加样回收率评价：称取干膏6份，精密称定，分别加入羟基红花黄色素A溶液10 mL（20 μg/mL），进样，测定羟基红花黄色素A的峰面积，计算RSD值。

1.4.4 甲瘤消颗粒中羟基红花黄色素A含量测定

取甲瘤消颗粒约4 g，研细，精密称定。将细粉放置于锥形瓶中，精密加入50 mL 25%甲醇溶液。称定锥形瓶重量，超声提取30 min。放冷后，再次称定锥形瓶重量。用25%甲醇补足提取过程中损失的重量。摇匀溶液，过滤。取10 μL滤液进行上样测定。

1.4.5 甲瘤消颗粒薄层鉴定

柴胡和玄参薄层色谱鉴别：照薄层色谱法（中国药典2020版四部通则0502）柴胡和玄参薄层色谱鉴别方法试验。取本品2袋，研细。加入40 mL甲醇，超声提取30 min。过滤，蒸干滤液。残渣加入20 mL水，以1∶1体积加水饱和正丁醇提取2次。按2∶1体积加氨试液洗涤，重复2次。取水饱和正丁醇蒸干，加甲醇，制备供试品溶液。取柴胡/玄参对照药材0.5 g/1 g，按同样方法制备对照药材溶液。取缺玄参/柴胡药材的其他八味药材，制成阴性对照品溶液。取样品各5 μL，点于硅胶薄层板上。以乙酸乙酯∶乙醇∶水（8∶2∶1）为展开剂进行展开。展开后取出，晾干，喷显色剂，加热至斑点显色清晰。置日光下检视。

青皮薄层色谱鉴别：按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0502中规定的薄层色谱法，进行青皮的薄层色谱鉴别。步骤如下：取本品2袋，按柴胡和玄参薄层色谱鉴别法制备残渣溶液。按1∶1体积加乙酸乙酯提取，重复2次，合并提取液。取青皮对照药材0.5 g，按同样方法制备对照药材溶液。取缺青皮药材的其他八味药材，制成阴性对照品溶液。取样品2 ~ 5 μL，点于硅胶G薄层板上。以甲苯∶甲醇∶冰醋酸（20∶4∶1）为展开剂进行展开。展开后取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。

当归薄层色谱鉴别：按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0502中规定的薄层色谱法，进行当归的薄层色谱鉴别。步骤如下：取本品2袋，研细，加入50 mL乙醚，超声提取10 min。过滤，蒸干滤液。加乙醇，制备供试品溶液。取当归对照药材0.5 g，按同样方法制备对照药材溶液。取缺当归药材的其他八味药材，同法制成阴性对照品溶液。取样品各2 ~ 20 μL，点于硅胶G薄层板上。以正己烷∶乙酸乙酯（4∶1）为展开剂进行展开。展开后取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。

1.4.6 甲瘤消颗粒急性毒性评价

取KM小鼠40只，随机分为空白组和给药组，实验前禁食不禁水12 h，称重后给药组每只小鼠以1.05 g/mL浓度，并按0.4 mL/10 g体重灌胃给药，24 h内给药2次，剂量为84 g/kg，空白组给予等体积的纯化水。于给药后即刻开始观察动物的毒性反应及死亡情况，自给药后次日起，每日观察动物。试验期间分别于给药后第1、3、7、14 d称重并记录每只动物体重，试验结束后对所有小鼠进行大体解剖，如发现组织器官发生改变时，需进一步进行组织病理学检查。本研究经兰州大学第一医院伦理委员会审批（批号：LDYYLL2022-510）。

1.5 统计学分析

采用 SPSS 13.0 进行统计学分析，计量资料数据用均数 ± 标准差(\overline{x} ± s)表示，两组均数差异比较采用 t-test双尾检验法，P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正交试验与重复实验验证结果

由正交试验直观分析表明，提取次数（C）、提取时间（A）和加水量（B）对药材水提效果的影响程度依次是C > A > B，各因素不同水平程度依次是A2 > A1 > A3、B1 > B2 > B3、C3 > C2 > C1。综合评价及考虑大工业生产，确定最佳水提工艺为A2B1C2，即：称取处方量药物，加入12倍量水后提取2次，每次1 h。重复实验测得羟基红花黄素A、阿魏酸、哈巴俄苷和橙皮苷得率平均值分别为14.08%、21.24%、42.12%和65.22%，平均干膏得率为33.20%。结果表明重复实验结果和正交试验综合评分最大值相当，表明该水提工艺稳定、可靠（表1-7）。

2.2 甲瘤消颗粒含量测定指标的优选结果

本研究分别建立当归中的阿魏酸（图1）、玄参中的哈巴俄苷（图2）、青皮中的橙皮苷（图3）和红花中的羟基红花黄色素A（图4）的液相色谱测定条件，分别测定甲瘤消颗粒、无当归阴性对照样品、无玄参阴性对照品、无红花阴性对照样品和无青皮阴性对照样品。结果表明，甲瘤消颗粒中阿魏酸、哈巴俄苷和橙皮苷测定存在阴性干扰，无法作为制剂含量测定指标。红花中的羟基红花黄色素A无阴性干扰，可纳入制剂含量测定指标进一步评价。

2.3 羟基红花黄素A测定方法学评价

羟基红花黄素A保留时间为6.77 min，以羟基红花黄色素A峰计理论塔板数均大于3 000，表明理论板数符合要求，且分离度良好（R > 1.5），无阴性干扰。以色谱峰面积为纵坐标（Y），以对照品溶液质量浓度为横坐标（X），作标准曲线，羟基红花黄色素A线性回归方程为y = 20 374 x + 38 663，相关系数r = 0.9988，羟基红花黄色素A峰面积与浓度（3.125 ~ 200） μg/mL呈良好的线性关系。精密度考察结果表明，羟基红花黄色素A的RSD为0.03%，表明该方法精密度良好；稳定性考察结果表明，分别在0、2、4、8、12、24 h测定羟基红花黄色素A的峰面积RSD为1.3%；重复性试验结果表明，干膏中羟基红花黄色素A含量测定结果的RSD为1.67%；干膏中羟基红花黄色素A的加样回收率范围为93.54% ~ 99.49%，平均加样回收率为97.08%，RSD为2.33%。甲瘤消颗粒三批样品的平均含量为317.75 μg/g，现参考第3批中试测定结果，同时基于红花不同原料中羟基红花黄色素A含量存在一定差异、工业化生产过程的损失、人为操作误差，提取率按照90%，将其三批样品中羟基红花黄色素A的平均含量再下浮至70%，317.75 μg/g × 90% × 70% ≈ 200.18 μg/g = 0.20 mg/g。限度暂定为：本品每g颗粒含红花以羟基红花黄色素A（C27H32O16）计，不得少于0.20 mg。

2.4 甲瘤消颗粒的薄层色谱鉴别

本研究建立了甲瘤消颗粒中柴胡、玄参、青皮和当归的薄层色谱鉴定方法，操作简便，显色清晰，阴性无干扰，该薄层鉴别方法可行，列入甲瘤消颗粒质量标准（图5-7）。

2.5 甲瘤消颗粒急性毒性评价结果

小鼠灌胃给予最大浓度1.05 g/mL、0.4 mL/10 g体重的供试品混悬液后，与空白组动物进行比较，其呼吸频率、体表颜色、运动功能等未见异常，连续观察14 d，动物体重增加（表8），未出现毒性反应及死亡。14 d后所有动物解剖肉眼未见明显的脏器改变。

3 讨论

大约60%的成年人患有1个或多个甲状腺结节，由甲状腺细胞局部异常生长引起且恶性变风险非常高^[16-17]。甲瘤消丸由海藻、当归等九味中药配伍组成，对甲状腺结节具有良好治疗作用，并可有效防止恶性变。改进后的甲瘤消颗粒能进一步提高制剂质量，方便患者服用，提高依从性。若在市场上推广，可更好发挥其在治疗甲状腺结节中的独特价值，为患者提供更优质的治疗选择。

中药复方制剂的临床疗效是由方中各味药物协同发挥作用的结果，复方有效成分提取率及干膏得率是反映制备工艺的主要指标，甲瘤消颗粒是在甲瘤消丸的基础上进行制剂工艺改进，为了保证制剂的有效性与安全性，研究采用水提法作为颗粒剂提取方法，且水煎提取方式为中医药制剂传统的制备方式。甲状腺疾病类属于中医“瘿病”的范畴^[18]。治法上应从整体观念出发对该病进行辨证论治，标本兼治，以理气活血、软坚散结、化痰消瘿为主要原则。甲瘤消处方的组成正是基于此原则，海藻咸寒，软坚散结、化痰消瘿为君药^[19-21]。柴胡、青皮、莪术和牡蛎在甲状腺疾病的治疗中具有一定的作用^[22-23]。柴胡和青皮疏肝解郁、破气，红花、莪术活血祛瘀，牡蛎软坚散结，瓜蒌化痰共为臣药。柴胡主要成分柴胡皂苷稳定性较差不易作为含量测定指标。药典组方中莪术、牡蛎和瓜蒌主要作为定性指标，且莪术主要成分莪术烯醇和瓜蒌主要成分3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇液相色谱定量较为困难，因此未将其作为重要考察指标。当归养血，以防攻消太过伤血^[23-25]，气痰郁久可以化热伤阴，故用元参清热滋阴，二药均为佐药。在水提工艺实验中，选择红花中的羟基红花黄素A、当归中的阿魏酸、元参中的哈巴俄苷和青皮中的橙皮苷和作为干膏得率为评价指标，按照正交实验设计优选最优提取工艺，再重复提取3次考察提取工艺的稳定性，最终筛选出水提取工艺为加入12倍量水，煎煮提取2次，每次1 h，提取工艺稳定可靠。

甲瘤消颗粒中的羟基红花黄素A含量测定无阴性干扰，液相色谱测定条件准确度高、分离度良好，可初步作为甲瘤消颗粒剂的含量测定指标。对当归中阿魏酸、玄参中哈巴俄苷及青皮中橙皮苷的含量测定也进行了相关研究，但由于甲瘤消颗粒中的3种化合物测定时存在阴性干扰，因此无法作为制剂的含量测定指标。甲瘤消颗粒中柴胡、玄参、青皮和当归薄层色谱鉴别中各斑点显色清晰，分离效果较好，阴性无干扰，可作为鉴别方法。此外，本研究对甲瘤消颗粒剂的安全性进行了评价，小鼠24 h内2次灌胃给予甲瘤消颗粒提取中间体混悬液，剂量为84 g/kg，未见明显毒性反应，其最大耐受剂量为84 g/kg，相当于人临床用量的140倍，结果表明，甲瘤消颗粒安全性较高。

4 结论

本研究通过正交实验筛选出甲瘤消颗粒的最优水提工艺为加入12倍量水，煎煮提取2次，每次1 h，提取工艺稳定可靠。通过对甲瘤消颗粒剂质量标准研究初步拟定甲瘤消颗粒的质量标准草案：鉴别项包括柴胡、玄参、青皮和当归。含量限度暂定为：本品每克颗粒含红花以羟基红花黄色素A（C27H32O16），不得少于0.20 mg，其他检查项遵照中国药典2020版四部颗粒剂（通则0104）项下的各项规定。小鼠甲瘤消最大耐受剂量为84 g/kg，相当于人临床用量的140倍，甲瘤消颗粒安全性较高。甲瘤消颗粒剂水提工艺的优化及质量标准和安全性研究为甲瘤消颗粒剂的开发奠定了理论与实验基础，可为甲状腺结节的临床治疗提供更优的治疗药物选择。

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基金资助

甘肃省重点研发计划-社会发展类项目(20YF3FA030)

甘肃省医院中药制剂产业技术创新联盟资助项目(202001)