刺五加皂甙靶向RIPK2抑制肺腺癌细胞增殖的机制研究

Mechanism of Acanthopanax Senticosus Saponins Inhibiting the Proliferation of LUAD Cells by Targeting RIPK2

摘要

目的 探讨刺五加皂甙（acanthopanax senticosus saponins，ASS）靶向受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸激酶2（receptor interacting serine/threonine kinase 2，RIPK2）抑制肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）细胞增殖的机制。 方法 细胞培养PC-9和A549细胞株并将其分为control组 、ASS组、RIPK2过表达组和ASS + RIPK2过表达组，检测不同ASS浓度下细胞存活率，克隆形成实验检查克隆细胞数，流式细胞仪检测各细胞周期PC-9和A549细胞数和凋亡率。观察不同时间移植瘤体质量，免疫组化检测Ki67表达。Western blot检测各组RIPK2表达水平。 结果 RIPK2表达量与肿瘤浸润深度、临床分期、淋巴结转移、是否复发、预后情况和生存率有关。ASS浓度越高，PC-9和A549细胞生存率及克隆细胞数明显降低（P < 0.05）。ASS组移植瘤组织的体积和质量、Ki67表达均明显少于control组（P < 0.05）。随着ASS作用时间增加和浓度升高，PC-9和A549细胞系中RIPK2的表达明显降低（P < 0.05）。与control组相比，ASS组G0/G1期PC-9和A549细胞数、细胞凋亡率明显升高，S期细胞数、RIPK2表达水平、PC-9和A549细胞活性和克隆细胞数明显降低（P < 0.05）；RIPK2组S期细胞数、RIPK2表达水平、癌细胞活性、克隆细胞数明显升高，G0/G1期PC-9和A549细胞数、细胞凋亡率明显降低（P < 0.05）；与ASS组相比，ASS + RIPK2组S期细胞数、RIPK2表达水平、癌细胞活性、克隆细胞数明显升高，G0/G1期PC-9和A549细胞数、细胞凋亡率明显降低（P < 0.05）。 结论 ASS可能通过靶向RIPK2，下调RIPK2表达水平，从而抑制LUAD细胞恶性增殖。

Abstract

Objective To analyze the mechanism of acanthopanax senticosus saponins （ASS） inhibiting the proliferation of lung adenocarcinoma （LUAD） cells by targeting receptor-interacting serine/threonine kinase 2 （RIPK2）. Methods PC-9 and A549 cell lines were cultured and divided into the control group， the ASS group， the RIPK2 overexpression group， and the ASS+ RIPK2 overexpression group. The survival rates of cells under different concentrations of ASS were detected by CCK-8. The number of clone cells was detected by clone formation assay. The number of PC-9 and A549 cells， and their apoptosis rates in each cell cycle were detected by flow cytometry. The body mass of xenograft tumors at different time points were observed. The expression of Ki67 was detected by immunohistochemistry. The expression levels of RIPK2 in each group were detected by Western Blot. Results The expression level of RIPK2 was related to depth of tumor invasion， clinical staging， lymph node metastasis， recurrence， prognosis， and survival rate. The higher the concentration of ASS， the lower the survival rates of PC-9 and A549 cells， and the number of clone cells （P < 0.05）. The volume and weight of xenograft tumors， and expression of Ki67 in ASS group were significantly lower than those in the control group （P < 0.05）. With the increase of ASS’ action time and concentration， the expression of RIPK2 in PC-9 and A549 cell lines was significantly decreased （P < 0.05）. Compared with the control group， number of PC-9 and A549 cells in G0/G1 phase， and apoptosis rate were significantly increased in the ASS group， while number of cells in S phase， expression level of RIPK2， activities of PC-9 and A549 cells， and the number of clone cells were significantly decreased （P < 0.05）. Compared with the control group， number of cells in S phase， expression level of RIPK2， activity of cancer cells and number of clone cells were significantly increased in RIPK2 group， while number of PC-9 and A549 cells in G0/G1 phase， and apoptosis rate were significantly decreased （P < 0.05）. Compared with the ASS group， number of cells in S phase， expression level of RIPK2， activity of cancer cells and number of clone cells were significantly increased in the ASS + RIPK2 group， while number of PC-9 and A549 cells in G0/G1 phase， and apoptosis rate were significantly decreased （P < 0.05）. Conclusion ASS may inhibit the malignant proliferation of LUAD cells by down-regulating the expression level of RIPK2.

Graphical abstract

关键词

刺五加皂甙 / 肺腺癌 / 细胞增殖 / 丝氨酸/苏氨酸激酶2

Key words

Acanthopanax senticosus saponins / Lung adenocarcinoma / Cell proliferation / Receptor-interacting serine/threonine kinase 2

肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是最常见的肺癌类型，约占总数的40% ~ 55%，早期可无明显症状，后期症状多样化并缺乏特异性^[1-3]。目前该病治疗以手术治疗和放疗为主，但由于个体差异大，部分患者身体条件不适合主流治疗方式^[4-6]。刺五加皂甙（acanthopanax senticosus saponins，ASS）是刺五加中提取的皂甙类成分，具有良好的药理活性和医疗价值^[7]。既往研究结果显示^[8-9]，ASS可通过抑制细胞周期，促进癌细胞凋亡发挥抗肿瘤活性和抑制肿瘤转移等作用。因此，ASS作为治疗多种肿瘤的潜在药物，受到了研究者们的广泛关注。研究显示^[10-12]，受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸激酶2（receptor interacting serine/threonine kinase 2，RIPK2）在结肠癌、乳腺癌中异常表达，因此猜想其表达可能与癌症发生发展有关，下调RIPK2表达或许是癌症防治的新思路。同时，RIPK2调节NOD1和NOD2介导的促炎信号，是自身免疫性和炎性疾病的又一个新兴的治疗靶点，为调控RIPK2水平在癌症方面的研究提供一定的理论基础。基于此，本研究分析了ASS靶向RIPK2抑制LUAD细胞增殖的作用机制，以期明确LUAD的可行治疗靶点，旨在为临床控制LUAD病情进展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与实验动物

CO₂培养箱、全自动酶标仪、流式细胞仪购自赛默飞；人LUADPC-9和A549细胞均购自深圳豪地华拓，批号分别为20220314、20210729；ASS由深圳海思安生物技术有限公司提供，批号为20210127；RPMI-1640培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自上海联硕宝，批号为20221125；CCK-8试剂盒由江西艾博因提供，批号为20220316； Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、ABC试剂盒均购自北京百奥莱博，批号分别为20211216、20220518；所有抗体均购自Abcam公司。

BALC/c裸鼠18只，雌雄各9只，5 ~ 7周龄，重约200 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，SPF级，生产许可证SCXK（沪）2017-0011。本研究经开封市中心医院伦理委员会批准（批号：20240403）。

1.2 ASS靶向RIPK2分析

SwissTarget和TargetNet（pro > 0）取并集为ASS靶点。利用在线分析工具分析（http://ualcan.path.uab.edu/cgi-bin/ualcan-res.pl）在LUAD中表达上调的基因。下载TCGA_LUAD表达数据和临床对应信息，对在LUAD中表达上调的基因进行乘积极限（Kaplan-Meier，K-M）分析，分析与总生存期相关的基因。

1.3 细胞培养及处理

PC-9和A549细胞培养于含10% FBS的RPMI-1640中，取一部分培养的PC-9和A549细胞，建立不同的ASS浓度梯度，PC-9细胞中ASS浓度梯度为（0、0.25、0.50、1.00、2.00）mg/mL，A549细胞中ASS浓度梯度为（0、0.5、1.0、1.5、2.0）mg/mL，观察不同ASS浓度下PC-9和A549细胞生长情况。

1.4 细胞增殖

取各组对数生长期细胞（2 × 10³个/mL）接种于96孔板，加入相应药物孵育，然后加入CCK-8溶液培养4 h，检测450 nm处吸光度值，重复测量3次，取平均值，绘制细胞生长曲线。

1.5 克隆形成试验检测细胞生长

取各组对数生长期细胞（2 × 10³个/mL）接种于96孔板，给予相应浓度的ASS处理细胞，待克隆生长到合适大小后，固定、染色，镜下观察细胞克隆数，重复测量3次，取平均值，并计算克隆形成率。

1.6 裸鼠移植瘤试验

给予裸鼠普通饲料，在20 ℃ 温度，50%湿度、12 h黑暗/明亮照明圈的人造环境中进行1 ～ 2周的适应期饲养，观察其行为和生理变化，筛选合格的裸鼠进行移植瘤实验。SPF条件下，ASS组裸鼠每隔1天注射1次ASS（50 mg/kg），control组为等量生理盐水，成瘤后每2天观察瘤体体积，共14 d。第15天处死后剥离肿瘤称重，重复测量3次，取平均值，免疫组化法检测组织Ki67表达。

1.7 构建过表达RIPK2细胞

通过脂质体Lipofectamin 2000转染，筛选2周，Western blot实验验证。取过表达成功的PC-9和A549细胞，一部分向PC-9和A549细胞中分别加入1.0 mg/mL和1.5 mg/mL ASS作为ASS + RIPK2组，另一部分为RIPK2组（RIPK2过表达）。另取正常培养的PC-9和A549细胞，不作任何处理为control组，分别向PC-9和A549细胞中加入1.0 mg/mL和1.5 mg/mL ASS作为ASS组。置于37 ℃、PH7.0 ~ 7.2、5% CO₂培养箱中培养24 h，取对数生长期细胞用于实验。

1.8 Western Blot检测RIPK2的表达

取control组 、ASS组、RIPK2组和ASS + RIPK2组PC-9和A549细胞，弃培养液，裂解提取总蛋白后，进行电泳，转膜，封闭，洗膜，加RIPK2一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜加二抗，室温孵育2 h。电化学发光显影后对比条带强弱，β-actin为内参。

1.9 流式细胞仪检测细胞周期细胞数和细胞凋亡

室温下配置碘化丙啶（Propidium，PI）染液（20 μg/mL），取对数生长期的PC-9和A549细胞配置成1 × 10⁶个/mL的细胞悬液，向一组PC-9和A549细胞中分别加入1.0 mg/mL和1.5 mg/mL ASS，另一组不作处理。各取2.0 mL细胞悬液，离心弃上清液，加入PI去污染液（20 μg/mL）2.0 mL，避光20 min上机（150 ~ 400个细胞/s），检测各细胞周期细胞数。后续实验中，control组、ASS组、RIPK2组和ASS + RIPK2组PC-9和A549细胞个细胞周期细胞数检测方法同上。

取对数生长细胞接种于6孔板，分为不染组、膜联蛋白 V（Annexin V）组、PI组以及PI + Annexin V双染组，流式细胞仪上机检测。通过软件分析，绘制散点图。

1.10 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数 ± 标准差（\overline{x} ± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，事后两两比较采用turkey检验；两组间比较采用t检验。P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RIPK2与LUAD临床病理特征的关系

SwissTarget和TargetNet（pro > 0）得到ASS的18个靶点。在线分析工具发现其中4个基因在LUAD癌细胞中表达上调，下载TCGA_ESCA表达数据和临床对应信息，对4个基因进行K-M分析，发现2个基因和总生存期相关，进一步分析这2个基因与LUAD的临床表型，结果发现RIPK2与LUAD临床表型较为密切。比起在癌旁组织中的表达，RIPK2在LUAD癌组织中表达明显升高（P < 0.05），且其表达量与肿瘤浸润深度、分期、淋巴结转移、是否复发、预后情况和生存率有关（P < 0.05），RIPK2表达水平高的细胞生存率明显低于RIPK2表达水平低的细胞生存率（P < 0.05），见图1。

2.2 ASS浓度与LUAD细胞活性的关系

ASS浓度越高，LUAD癌细胞PC-9和A549的细胞生存率越低，当PC-9和A549细胞中ASS浓度分别为1.0 mg/mL和1.5 mg/mL时，细胞生存率约降低至50%（P < 0.05），见图2。

2.3 ASS体外抑制LUAD细胞增殖

ASS作用时间越长，PC-9和A549细胞生存率明显降低（P < 0.05）。克隆形成实验结果显示，ASS组PC-9和A549克隆细胞数明显少于control组（P < 0.05）。流式细胞仪检测结果显示，ASS组G₀/G₁期PC-9和A549细胞数明显高于control组（P < 0.05），S期PC-9和A549细胞数明显低于control组（P < 0.05），G₂/M期PC-9和A549细胞数与control组相比，无明显差异（P > 0.05）。流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，ASS组PC-9细胞凋亡率为14.99%明显高于control组 PC-9细胞凋亡率的4.80%（P < 0.05）；ASS组A549细胞凋亡率为16.70%明显高于control组 A549细胞凋亡率的5.40%（P < 0.05），见图3。

2.4 ASS体内抑制LUAD细胞增殖

ASS组移植瘤体积、质量以及Ki67表达均明显少于control组（P < 0.05），见图4。

2.5 ASS通过RIPK2抑制LUAD细胞增殖

PC-9和A549细胞系中RIPK2的表达呈时间和浓度依赖（P < 0.05）。与control组相比，RIPK2组RIPK2表达水平明显升高，ASS组RIPK2表达水平明显降低（P < 0.05）；CCK-8实验和克隆形成实验结果显示，与control组相比，RIPK2组PC-9和A549细胞活性和克隆细胞数明显升高，ASS组PC-9和A549细胞活性和克隆细胞数明显下降（P < 0.05）；与ASS组相比，ASS+RIPK2组PC-9和A549细胞活性和克隆细胞数明显升高（P < 0.05）。流式细胞仪检测结果显示，与control组相比，ASS组G₀/G₁期的PC-9和A549细胞数明显升高，S期PC-9和A549细胞数明显降低（P < 0.05）；RIPK2组G₀/G₁期PC-9和A549细胞数明显降低，S期PC-9和A549细胞数明显升高（P < 0.05）；与ASS组相比，ASS+ RIPK2组G₀/G₁期PC-9和A549细胞数明显降低，S期PC-9和A549细胞数明显升高（P < 0.05）。与control组相比，RIPK2组PC-9和A549细胞凋亡率明显下降（P < 0.05），ASS组PC-9和A549细胞凋亡率明显上升（P < 0.05），ASS+ RIPK2组PC-9和A549细胞凋亡率无明显差异（P > 0.05），见图5。

3 讨论

LUAD的发病原因迄今尚不明确，临床上常以综合多学科意见的个体化治疗为主要治疗原则^[13-16]。因此，本研究以LUAD癌细胞株PC-9和A549为研究对象，分析ASS靶向RIPK2的作用机制。

本研究结果显示，RIPK2在LUAD癌组织中表达明显升高，RIPK2表达水平越高代表LUAD恶性程度越高，预后越差，生存率越低。因此，通过抑制RIPK2表达可能实现抑制LUAD恶性生物学的目的，提高患者预后。已有研究证实^[17-18]，ASS对癌细胞生长转移有抑制作用，且随剂量增加抑制作用越明显。本研究结果显示，ASS浓度越高、作用时间越长，LUAD癌细胞生存率明显降低，说明ASS对抑制LUAD细胞恶性增殖具有良好的药理活性，且抑制作用具时间和浓度依赖性。

有丝分裂是细胞增殖最主要的方式，有维持个体正常生长发育的重要生物学意义。正常细胞按细胞周期有序地进行有丝分裂，并在机体正常调控下凋亡，使机体处于增殖与凋亡相对平衡的状态。癌细胞因癌基因被激活或抑癌基因失活等原因具有无限增殖的潜力，同时恶性肿瘤细胞能摆脱正常细胞凋亡程序，打破体内相对平衡的状态，导致一系列恶性生物学行为^[19-20]。因此，促使癌细胞凋亡和阻碍癌细胞进行有丝分裂是抑制肿瘤细胞恶性增殖的两种思路。本研究结果一方面说明ASS可以促使LUAD细胞凋亡，另一方面又说明ASS将LUAD细胞PC-9和A549阻碍在细胞间期，阻碍了其有丝分裂进程，从阻碍增殖和促进凋亡两个方面抑制了LUAD细胞的恶性生物学行为。既往研究表明^[21-23]，ASS可以诱导体外肺癌细胞凋亡，并影响肺癌细胞DNA合成，从而影响肺癌细胞的增殖与生长，与本研究结果一致。本研究中，ASS将LUAD细胞PC-9和A549阻碍在细胞间期，抑制LUAD细胞PC-9和A549细胞周期的转换，使之无法正常进行有丝分裂，从而抑制了其恶性增殖。细胞凋亡的结果也进一步说明，ASS通过抑制LUAD细胞增殖，促使其凋亡。

研究证实^[24-26]，Ki67与有丝分裂密切相关，是反应肿瘤增殖最具有代表性的指标，移植瘤实验结果说明ASS可以抑制LUAD癌细胞恶性增殖。本研究结果显示，RIPK2过表达会导致LUAD细胞活性和克隆细胞数明显升高，加入ASS能够抑制RIPK2的表达，降低癌细胞活性，并且ASS浓度越高或者作用时间越长，RIPK2的表达量越低，说明RIPK2的表达与LUAD细胞PC-9和A549的细胞活性具有一致性，而ASS可以通过靶向抑制RIPK2表达，从而抑制LUAD细胞增殖水平，同时RIPK2对ASS的抑癌效果有逆转作用。通过对比不同组不同细胞周期细胞数，发现ASS组G0/G1期的PC-9和A549细胞数明显升高，S期细胞数明显降低；RIPK2过表达的情况下，G0/G1期的LUAD细胞数明显降低，S期细胞数明显升高，该结果说明RIPK2可能通过调节细胞周期，影响细胞增殖。本研究结果显示，RIPK2组LUAD细胞凋亡率明显下降，ASS组细胞凋亡率明显上升，说明ASS可以阻碍PC-9和A549细胞正常有丝分裂进程，而过表达RIPK2可以推进有丝分裂过程，ASS通过抑制RIPK2表达水平，从而使LUAD细胞无法通过有丝分裂进行恶性增殖，并促使其凋亡。

4 结论

ASS可能通过靶向作用于RIPK2，下调其表达，从而阻碍LUAD肿瘤细胞正常有丝分裂进程，促使其凋亡，遏制LUAD肿瘤细胞恶性增殖与生长。

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基金资助

河南省医学科技攻关计划(联合共建)项目(LHGJ20191168)