超声介导脂质微泡的高效骨骼肌基因递送体系用于黑色素瘤的免疫治疗

Ultrasound-mediated Skeletal Muscle Gene Delivery System of Lipid Microvesicles for Immunotherapy of Melanoma

摘要

目的 建立新型非病毒载体介导的基因递送/表达体系，将活体局部骨骼肌细胞改造成“智能化药物生产工厂”，生产治疗性蛋白类药物，通过血液循环到达并识别其靶点（分子、细胞、器官或组织），为机体提供持续不断的蛋白类药物供给。 方法 首先，将液态全氟己烷（perfluorohexane， PFH）引入脂质体（liposome，Lipo）内形成Lipo-PFH脂质微泡，通过定向超声波调控使PFH发生液-气相变，产生超声靶向微泡破坏（ultrasound-targeted microvesicle destruction， UTMD）效应，将Lipo-PFH脂质微泡搭载的质粒DNA（plasmid DNA，pDNA）高效、安全传递到骨骼肌细胞中进行表达。然后，通过琼脂糖凝胶电泳探究Lipo和pDNA在不同质量比条件下的结合情况；采用人胚肾细胞HEK-293T和小鼠成肌细胞C2C12评估Lipo-PFH的细胞毒性；采用琼脂糖凝胶孔洞模型研究超声波引发Lipo-PFH发生相变的情况；利用表达报告基因的质粒pLuc进行体内基因递送效率的优化。最后，利用表达免疫检查点抑制剂的功能质粒（基因药物，pα-PD-1和pα-CTLA-4）对黑色素瘤荷瘤小鼠进行治疗，评估治疗效果。 结果 ①Lipo平均粒径和Zeta电位分别为139.4 nm和33.1 mV；Lipo-PFH平均粒径和Zeta电位分别为261.6 nm和39.6 mV。琼脂糖凝胶电泳筛选出最佳的复合质量比为7∶1，并通过Zeta电位分析进行证实。②Lipo-PFH浓度增加到50%，细胞活力依然保持在90%左右。③体外条件下证实温度60℃或超声功率2 W/cm²、时间2 min可引发Lipo-PFH中的PFH产生液-气相变，进而在体内条件下优化超声功率和时间对Lipo-PFH中PFH相变的影响。④以2 W/cm²、3 min超声21 d仍可检测到荧光素酶表达信号。治疗组小鼠肿瘤生长缓慢（24 d内均维持在100 mm³左右），肿瘤质量最小，小鼠生存率最高，瘤内浸润的CD8⁺T细胞比例显著增加。治疗20 d后，病理学分析显示各组小鼠心、肝、脾、肺、肾和肌肉等均未见病理改变。 结论 利用脂质微泡技术，将表达PD-1和CTLA-4抗体的质粒高效递送到黑色素瘤小鼠骨骼肌细胞中，为自体持续生产、供给抗体药物，可安全有效地控制黑色素瘤的生长。

Abstract

Objective Establish a novel non-viral vector-mediated gene delivery/ expression system to transform local skeletal muscle cells in vivo into “intelligent drug production factories”， which produce therapeutic protein drugs and deliver them to their targets （molecules， cells， organs or tissues） through the blood circulation for continuous supply of protein drugs to the body. Methods First， liquid perfluorohexane （PFH） was introduced into liposomes （Lipo） to form Lipo-PFH lipid microbubbles， and the PFH underwent a liquid-gas phase transition through targeted ultrasonic modulation， resulting in an ultrasound-targeted microbubble disruption （UTMD） effect， which efficiently and safely delivered plasmid DNA （pDNA） piggybacked on Lipo-PFH lipid microbubbles to skeletal muscle cells for Expression. Then， the binding of Lipo and pDNA was explored by agarose gel electrophoresis under different mass ratio conditions. The cytotoxicity of Lipo-PFH was assessed using human embryonic kidney cells HEK-293T and mouse adult myocytes C2C12. An agarose gel hole model was used to study the ultrasound-triggered phase transition of Lipo-PFH. Plasmid pLuc， which expresses a reporter gene， was used for optimization of gene delivery efficiency in vivo. Finally， the therapeutic effects were evaluated using functional plasmids expressing immune checkpoint inhibitors （gene drugs， pα-PD-1， and pα-CTLA-4） in melanoma-loaded mice. Results ①The average particle size and zeta potential of Lipo were 139.4 nm and 33.1 mV， respectively. The average particle size and zeta potential of Lipo-PFH were 261.6 nm and 39.6 mV， respectively. The optimal composite mass ratio was screened by agarose gel electrophoresis to be 7∶1， which was confirmed by zeta potential analysis. ②The concentration of Lipo-PFH was increased to 50% and cell viability remained around 90%. ③ In vitro conditions confirmed that the temperature of 60°C or ultrasound power of 2 W/cm² and time of 2 min could trigger the liquid-gas phase transition of PFH in Lipo-PFH， and then optimized the effects of ultrasound power and time on the phase transition of PFH in Lipo-PFH under in vivo conditions. ④ The luciferase expression signal could still be detected by ultrasound at 2 W/cm² for 3 min for 21 d. The tumor growth of the mice in the treatment group was slow （around 100 mm³ for 24 d）. The mice in the treatment group showed slow tumor growth （all maintained around 100 mm³ for 24 d）， the smallest tumor mass， the highest survival rate of mice， and a significant increase in the proportion of CD8⁺ T cells infiltrated in the tumor. After 20 days of treatment， pathological analysis showed that no pathological changes were observed in the heart， liver， spleen， lungs， kidneys， or muscles of mice in any group. Conclusion Using lipid microbubble technology， plasmids expressing PD-1 and CTLA-4 antibodies were efficiently delivered into skeletal muscle cells of melanoma-bearing mice for continuous production and supply of antibody drugs for autologous， which can safely and effectively control the growth of melanoma.

Graphical abstract

关键词

脂质微泡 / 超声靶向微泡破坏 / 原位基因递送 / 基因药物 / 免疫治疗 / 黑色素瘤

Key words

Lipid microbubbles / Ultrasound-targeted microvesicle destruction / In situ gene solution / Gene medicine / Immunotherapy / Melanoma

脂质体是类脂质（磷脂等）分散于水中所形成的具有双分子层包裹水相结构的封闭小囊泡，引入气体内核则称为脂质微泡。气体内核能够增强超声成像的效果，因此脂质微泡作为造影剂在超声成像领域得到广泛的应用^[1-2]。除此以外，借助超声靶向微泡破坏（ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD）技术，脂质微泡还可作为药物递送载体^[3-5]。该技术利用超声波（ultrasonic，US）破碎脂质微泡，诱发空化与声孔效应，增大细胞间距，诱导细胞膜瞬时穿孔，可增强膜渗透性。微泡破裂时伴随的机械力可推动微泡内药物渗透至目标组织/细胞，实现精准药物递送^[6-7]。通过调整超声参数，可使细胞膜产生可逆性孔洞，细胞膜恢复完整性后，递送的药物可以在细胞内继续发挥相应的作用^[8-10]。相较于气体内核，液体内核（如液态氟碳烷烃）在超声波作用下气化、膨胀导致微泡破裂，可产生更强的UTMD效应^[11]。DELALANDE等^[12]研究发现，使用BR14微泡递送基因，可以在跟腱中进行高效和持续的基因转移。SANCHES等^[13]通过静脉注射裸质粒pLuc和SonoVue®微气泡，再对骨骼肌进行超声检查，发现相应基因表达增加。

机体免疫应答过程中，免疫检查点通过调节T细胞的活化和功能来维持免疫平衡^[14]。目前，程序性死亡受体1（programmed death 1, PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4）是最主要的免疫检查点，其抑制剂药物如抗体PD-1、PD-L1和CTLA-4已经在黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌等多种癌症治疗中取得了显著疗效^[15-17]。

人体骨骼肌分布广、体积大、血管丰富，通过肌内注射的方式将携带目的基因的质粒DNA（plasmid DNA，pDNA）传递到患者骨骼肌细胞中，以该细胞为“工厂”来“生产”治疗性蛋白类“药物”并分泌出细胞，再通过血液循环到达并识别其靶点(分子、细胞、器官或组织)，持续发挥治疗作用，有望实现真正的个体化、精准化治疗^[18-19]。因此本研究建立一种新型非病毒载体介导的基因递送/表达体系，将活体局部骨骼肌细胞改造成“智能化药物生产工厂”，生产治疗性蛋白类药物，并检测其对黑色素瘤小鼠的治疗效果。

1 材料和方法

1.1 实验试剂

DC-胆固醇（3β-[N-(N',N'-Dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol,DC-CHOL）购自Avanti Polar Lipids；二棕榈酰磷脂酰胆碱（1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine,DPPC）和全氟己烷（perfluorohexane,PFH）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N [maleimide(polyethylene glycol)],DSPE-PEG-2000）购自安耐吉化学有限公司。表达荧光素酶的质粒（pLuc）、表达PD-1单抗的质粒（pα-PD-1）和表达CTLA-4单抗的质粒（pα-CTLA-4）均由本实验室前期构建并保存。

1.2 Lipo/Lipo-PFH脂质微泡制备与验证

1.2.1 Lipo/Lipo-PFH脂质微泡制备

将4.0 mg DPPC、2.5 mg DC-CHOL、1.5 mg DSPE-PEG-2000装入50 mL茄形瓶中，加入3 mL三氯甲烷混合均匀使其完全溶解。在35℃旋转蒸发仪上减压蒸馏30 min除去有机溶剂，随后用油泵抽真空干燥3 h，在室温下形成脂质膜。加入50 μL PFH浸润脂膜，用2 mL含10%(vol/vol)甘油的磷酸盐再水化脂膜缓冲液（PBS 1×，pH = 7.4）在室温下水合并将脂膜轻轻吹下，先通过均质匀浆机在8 000 rpm下搅拌5 min，之后通过超声细胞破碎仪在冰浴中超声处理5 min（脉冲持续时间5 s，脉冲间隔5 s），所得Lipo-PFH脂质微泡溶液储存在4 ℃冰箱中。空白Lipo脂质微泡溶液的制备方法与上述过程类似，但不加入PFH。

1.2.2 Lipo/Lipo-PFH脂质微泡表征

采用透射电子显微镜对制备的Lipo和Lipo-PFH脂质微泡形貌和直径进行表征，记录平均粒径及Zeta电位。将1 mL样品溶液转移至乳胶套内，扎紧乳胶套后置于涂有耦合剂的超声探头上，1 MHz、2 W/cm²超声处理60 s，用磷钨酸负染后观察微泡样品在超声前后及不同超声时间后的形貌和结构的变化。

1.2.3 Lipo/Lipo-PFH脂质微泡体外超声

将1 mL Lipo或Lipo-PFH脂质微泡溶液分别加入2 mL EP管中并分别置于0、40、60、80和90 ℃中恒温水浴孵育。待EP管中液体温度达到水浴温度后，转入琼脂糖凝胶孔洞模型中并用多功能彩色多普勒超声诊断仪采集B模式（B-mode）超声图像和对比增强超声（contrast-enhanced ultrasound, CEUS）图像，探究温度对体外超声引发Lipo/Lipo-PFH相变的影响。分别使用功率为1.0 和2.0 W/cm²的超声波辐照0、30、60、90和120 s，再次采集B-mode图像和CEUS图像，探究功率和时间对超声引发Lipo-PFH相变的影响。

1.2.4 Lipo-PFH脂质微泡细胞毒性及稳定性

按照1.2.1方法制备C₆F₁₄含量分别为0、10、30、50和70 μL的Lipo-PFH，使用纳米粒度及电位分析仪测定其在1、4、7 d内的粒径变化，验证稳定性。使用HEK293T和C2C12细胞，采用CCK-8法评价脂质微泡的细胞毒性。将上述细胞在正常条件（含10%胎牛血清的DMEM培养基，37°C，5% CO₂）下培养24 h，加入不同浓度的Lipo-PFH脂质微泡溶液（C₆F₁₄含量为50 uL）孵育24 h后，每孔加入CCK-8试剂10 μL，再孵育1 ~ 2 h，随后用酶标仪在450 nm处检测每孔的吸光度。

1.3 Lipo-PFH质粒复合物制备及血清稳定性

1.3.1 Lipo-PFH质粒复合物制备

根据Lipo-PFH和质粒pcDNA3.1-Luciferase（pLuc）不同质量比（0∶1、1∶1、2:∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、16∶1和17∶1）制备复合物，每次使用的复合物现用现配。具体操作如下：吸取1.6 μg pLuc至200 μL EP管中，按照不同质量比分别吸取不同体积Lipo-PFH溶液至EP管混合，移液器轻轻吹打10次，涡旋数秒后静置10 min，记录平均粒径及Zeta电位。

1.3.2 Lipo-PFH质粒复合物血清稳定性

将1 mL 上述复合物（C₆F₁₄含量为50 ul）分散于2 mL含10% 胎牛血清的PBS 1× 缓冲液（pH = 7.4）中，置于恒温震荡箱中孵育72 h。于0、10、20、30、40、50、60、70和80 h各吸取1 mL样品溶液，测定其粒径，并绘制粒径随时间变化的曲线。

1.4 Lipo-PFH质粒复合物小鼠体内实验

1.4.1 实验动物

BALB/c、C57BL/6小鼠，SPF级，均购自斯贝福生物技术公司（中国北京），正常饮食饮水，适应性喂养1 w。动物实验均严格依照四川大学实验动物管理规定进行，并经四川大学华西医院生物医学研究伦理委员审核批准（批号：20221404）。

1.4.2 报告基因递送

BALB/c小鼠随机分3组，每组5只：0 W/cm²、0 min，2 W/cm²、2 min和2 W/cm²、3 min。大腿肌内注射pLuc/Lipo-PFH复合物40 μL（含20 μg pLuc、25 μL Lipo-PFH），随后浸入水中，将超声探头紧贴注射位点，以频率1 MHz、占空比60%，超声处理分别为0、 2、 3 min。超声处理后，将D-荧光素底物按照150 mg/kg体重剂量对小鼠进行腹腔注射，在1、4、7、14、21 d分析小鼠体内报告基因表达情况。

1.4.3 小鼠黑色素瘤模型建立

将重悬于PBS 1×缓冲液中的B16 F10黑色素瘤细胞调整浓度为1 × 10⁷ /mL，取200 μL接种到C57BL/6小鼠右前腋下。将肿瘤接种日期设定为第0 d，当肿瘤体积达到约50 mm³时，提示建模成功。

1.4.4 报告基因抗肿瘤作用

将建模成功的小鼠随机分为4组，每组10只：PBS 1× 注射组、US + pα-PD-1 + pα-CTLA-4注射组、Lipo-PFH + pα-PD-1 + pα-CTLA-4注射组、US + Lipo-PFH + pα-PD-1 + pα-CTLA-4注射组。按照1.3.1中最佳质量比制备pα-PD-1 / pα-CTLA-4 Lipo-PFH复合物。建模后第7 d和第12 d向各组小鼠大腿骨骼肌各注射1次总体积105 μL的相应溶液，其中pα-PD-1和pα-CTLA-4均为40 μg，Lipo-PFH为75 μL，均按照频率1 MHz、功率2 W/cm²、占空比60%的参数立即超声3 min。用游标卡尺每2 d测量1次肿瘤的长径(a)和短径(b)，并称量小鼠体重。按照公式计算肿瘤体积：V = (a × b²)/2，绘制肿瘤生长曲线。

1.4.5 生物安全性分析

从1.4.4小鼠眼底静脉丛采集外周血，进行血常规及肝功能和肾功能检测。收集小鼠的主要脏器，包括心、肝、脾、肺、肾以及注射部位骨骼肌，通过HE染色进行病理切片观察，判断不同组脏器和肌肉是否发生病变。

1.5 统计学方法

使用GraphPad Prism 10软件进行统计描述和分析。计量资料使用均数 ± 标准差(\overline{x} ± s)表示，对所有连续变量进行正态性检验，采用t检验进行两组间比较，单因素方差分析（one-way ANOVA）进行四组间差异分析，Tukey检验进行事后组间两两比较。P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Lipo/Lipo-PFH脂质微泡表征

Lipo脂质微泡的平均粒径和Zeta电位分别为139.4 nm和33.1mV， 见图1A、1B；Lipo-PFH脂质微泡的平均粒径和Zeta电位分别为261.6 nm和39.6 mV，见图1C、1D。超声前Lipo和Lipo-PFH脂质微泡的形态呈近球形，具有规则核壳结构形态，见图2A、2B；持续超声60 s后，Lipo脂质微泡未见明显变化，而Lipo-PFH脂质微泡的尺寸明显增加，规则核壳结构消失，出现很多形状不规则的颗粒，见图2C、2D。

2.2 温度对体外超声引发Lipo/Lipo-PFH产生相变的影响

在常规的B模式和CEUS模式下，Lipo组的回声信号均很弱，并且从0到90℃均没有变化，说明Lipo分子本身没有发生明显变化；Lipo-PFH组从0到60℃回声信号逐渐增强，80℃时回声信号反而减少，90℃时几乎检测不到回声信号，见图3。

2.3 功率和时间对超声引发Lipo-PFH产生相变的影响

超声辐照前（0 s），B模式和CEUS模式下体外凝胶孔洞模型中Lipo-PFH的回声信号均很低。超声辐照后，两种模式、两种功率下回声信号均随时间增强，2 W/cm²功率下60 s和90 s时的信号强度均最高，说明体外模拟实验中优化的超声条件为2 W/cm²、60 ~ 90 s，见图4A。对体内超声成像效果随时间变化的研究发现，使用功率2 W/cm²，超声30 ~ 60 s后Lipo-PFH出现高回声，造影模式下显像明显增强，见图4B。

2.4 Lipo-PFH的体外细胞毒性及稳定性

Lipo-PFH浓度增加到50%，细胞活力依然保持在90%左右，说明Lipo-PFH的细胞毒性非常低，见图5A、5B。7 d内，C₆F₁₄含量不同的Lipo-PFH阳离子脂质微泡粒径没有发生显著变化（P > 0.05），展现出较好的稳定性，见图5C。

2.5 Lipo-PFH/pLuc复合物质量比优化

脂质体Lipo-PFH与pLuc复合比为7∶1时，Lipo-PFH组中大部分pLuc被阻滞，少部分向正极移动，表明Lipo-PFH与带负电pDNA可以通过静电作用进行有效结合，见图6A。随着质量比增加，复合物Zeta电位逐渐变化，在7∶1时基本接近电中性，与电泳结果相吻合，见图6B。在37℃、含10% FBS的PBS 1× （pH = 7.4）溶液中，Lipo-PFH/pLuc复合物在80 h内粒径没有发生显著变化（P > 0.05），表明Lipo-PFH/pLuc具备较好的血清稳定性，见图6C。

2.6 超声介导的pLuc/Lipo-PFH报告基因肌肉内表达

将pLuc/Lipo-PFH复合物进行BALB/c小鼠大腿肌肉内注射后，无超声（0 W/cm²、0 min）的情况下，部分小鼠在4 d内检测到较弱荧光素酶表达信号；2 W/cm²的情况下，无论在表达强度还是持续时间方面，超声3 min均比超声2 min有明显优势，在21 d后依然能检测到荧光素酶表达信号，见图7。因此，2 W/cm²超声3 min可作为体内基因递送的参数。

2.7 超声介导Lipo-PFH基因药物用于小鼠黑色素瘤治疗

治疗后，US + Lipo-PFH + pα-PD-1 + pα-CTLA-4组小鼠肿瘤生长几乎停滞，与Untreated组相比具有显著差异（P < 0.001）；US + pα-PD-1 + pα-CTLA-4和Lipo-PFH + pα-PD-1 + pα-CTLA-4组也具备一定延缓肿瘤生长的作用，但与Lipo-PFH + pα-PD-1 + pα-CTLA-4组相比，抗肿瘤效果有限（P < 0.05），见图8A、8B。US + Lipo-PFH + pα-PD-1 + pα-CTLA-4组小鼠生存率明显升高，见图8E。治疗期间，各组间小鼠体重没有显著差异，见图8F。这些结果表明，超声结合Lipo-PFH所产生的UTMD效应是进行原位肌肉内高效递送基因药物的必要条件，由此表达的两种免疫检查点抑制分子α-PD-1和α-CTLA-4联用可产生良好的抗黑色素瘤作用。

2.8 超声介导Lipo-PFH基因药物肌内递送/表达安全性

血常规各项指标均在正常范围；生化各指标未出现明显异常，见图9A-C。心、肝、脾、肺、肾和肌肉等均未见病理改变，见图9D。结果表明超声Lipo-PFH复合免疫检查点抑制剂基因药物肌内递送/表达治疗小鼠黑色素瘤具有良好的生物安全性。

3 讨论

液态氟碳具有低毒性、低黏度、易发生液气相变和良好稳定性的特点，因此基于液态氟碳的超声增强剂己经成为近年研究热点^[20]。全氟己烷PFH是一种难溶于水和有机溶剂的液态氟碳，具有良好的生物相容性。与传统常用的全氟戊烷（沸点29℃）相比，PFH的沸点为56℃，不容易气化，保存或制作脂质体微泡（Lipo-PFH）都相对容易。Lipo-PFH带正电荷，与带负电荷的pDNA混合后，二者通过静电吸附作用，可形成pDNA/Lipo-PFH复合物。其中，Lipo-PFH与pDNA的比例将决定复合物的表面电位，对复合物高效进入骨骼肌细胞有着重要影响^[21-22]。本研究通过琼脂糖凝胶电泳筛选出Lipo-PFH与pDNA的最佳复合质量比为7∶1，并通过Zeta电位分析进行证实。

免疫检查点抑制剂能够通过阻断T细胞活化的抑制信号来激发针对肿瘤的免疫应答^[23-24]。本研究所使用的Lipo-PFH以氟化烷烃为内核，在超声波作用下发生液-气相变，脂质微泡迅速膨胀，在极短时间破裂并产生高速射流，使邻近的细胞膜通透性增加、微血管通透性增加、内皮间隙增宽，产生UTMD效应，有助于将其运载的免疫检查点抑制剂释放并高效送入肌肉细胞内，进而持续生产抗体药物。

UTMD效应的应用广泛，主要包括以下几个方面：①通过靶向肿瘤部位输送抗肿瘤药物、毒素或基因治疗药物，如siRNA、自杀基因等，提高治疗效果同时减少对正常组织的损伤^[25]；②通过递送生长因子、血管生成因子等促进血管新生或心肌修复，用于治疗心肌梗死等^[26]；③结合增强剂作为超声成像对比剂，增强图像分辨率，帮助更准确地诊断肿瘤边界、血栓等疾病^[27]。上述应用均是通过瘤内注射或静脉注射，脂质微泡会随血液循环分布到全身各处，大部分被健康组织过滤清除，少部分到达心脏，尤其是心肌梗死区域^[28]。与常规直接注射抗体药物的治疗策略不同，本研究通过向小鼠骨骼肌细胞递送可表达抗体药物的功能质粒，让肌肉细胞为自体持续生产抗体，达到治疗目的。US + Lipo-PFH既能产生增强超声造影成像的效果，其UTMD效应还可将pα-PD-1和pα-CTLA-4两种基因药物高效传递到肌肉细胞中并生产抗体，对黑色素瘤产生良好的治疗效果。“US + Lipo-PFH + 基因药物”体系具有安全、有效、经济等特点。除了黑色素瘤，使用不同的基因药物，有望为更多种肿瘤，甚至其他非肿瘤类病变，提供同样有效、安全、经济的治疗方案。

4 结论

本研究将液态全氟己烷（PFH）包裹于阳离子脂质体内部，获得一种脂质微泡Lipo-PFH。在体外合适参数定向超声波调控下，Lipo-PFH发生液-气相变，可极大地提高超声成像质量。此外，Lipo-PFH与pDNA通过静电作用可形成稳定复合物，发挥基因药物载体作用。肌内注射后，通过超声波调控可使Lipo-PFH在极短时间膨胀、破裂并形成高速射流，产生空化效应使邻近的细胞膜通透性增加，并将其运载的基因药物pDNA释放、传递到肌肉细胞内，将活体局部骨骼肌细胞改造成“智能生产工厂”，持续生产蛋白类药物进行疾病治疗，具有安全、有效、经济、便捷、开放等特点。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31971390)