多波长视网膜血氧仪在巴马小猪视网膜血管参数中的检测价值

Detection Value of Multi-Wavelength Retinal Oximeter in Retinal Vascular Parameters of Bama Mini Pigs

摘要

目的 采取不同血氧检测手段，探讨多波长视网膜血氧仪间接检测与金标准直接检测结果的相关性及准确性。 方法 6只巴马小猪分别吸入浓度为10%、21%、100%的氧气，当外周脉搏氧饱和度达到稳定水平时，通过股动脉血气分析检测股动脉血氧饱和度；通过O₂微传感器损伤性地穿刺巴马小猪视网膜检测玻璃体内血氧饱和度；通过Ⅰ型、Ⅱ型多波长视网膜血氧仪无创检测视网膜血氧饱和度和动静脉管径。 结果 股动脉血氧饱和度和玻璃体内血氧饱和度相关（P < 0.05），玻璃体内血氧饱和度与视网膜血氧饱和度相关（P < 0.05），Ⅰ型与Ⅱ型多波长视网膜血氧仪精确度无差异（P > 0.05）。在吸入10%浓度氧气的情况下，Ⅰ型与Ⅱ型多波长视网膜血氧仪测得动静脉管径有差异（P < 0.05）；在吸入21%浓度氧气和100%浓度氧气的情况下，Ⅰ型与Ⅱ型多波长视网膜血氧仪测得动静脉管径无差异（P > 0.05）。 结论 多波长视网膜血氧测定法对巴马小猪全身血氧饱和度变化较敏感；Ⅰ型与Ⅱ型多波长视网膜血氧仪精确度无差异。本实验明确了两种多波长视网膜血氧仪检测视网膜血氧饱和度的可靠性，为多波长视网膜血氧仪的临床应用提供了循证科学依据。

Abstract

Objective Adoption of different means of oximetry to explore the correlation and accuracy of the indirect test results of multiwavelength retinal oximetry and the direct test results of the gold standard. Method Six Parma piglets inhaled oxygen at 10%， 21%， and 100% concentrations. When peripheral pulse oximetry reached a stable level， femoral artery oxygen saturation was detected through femoral artery blood gas analysis. Intravitreal oxygen saturation was detected by damaging puncture of the retina of Bama piglets by O₂ microsensors. Retinal oxygen saturation and arteriovenous canal diameter were detected noninvasively by type Ⅰ and type Ⅱ multi-wavelength retinal oximetry. Result Femoral artery oxygen saturation correlated with intravitreal oxygen saturation （P < 0.05）， and intravitreal oxygen saturation correlated with retinal oxygen saturation （P < 0.05）， and there was no difference in accuracy between type Ⅰ and type Ⅱ multi-wavelength retinal oximeters （P > 0.05）. There was a difference in arterial and venous vessel diameters between Type Ⅰ and Type Ⅱ multi-wavelength retinal oximeters （P < 0.05） when 10% oxygen was inhaled， and there was no difference in arterial and venous vessel diameters between Type Ⅰ and Type Ⅱ multi-wavelength retinal oximeters （P > 0.05） when 21% and 100% oxygen were inhaled. Conclusion Multi-wavelength retinal oximetry is sensitive to systemic blood oxygen saturation changes in Bama mini pigs. Type Ⅰ and Type Ⅱ oximeters demonstrate consistent accuracy. This study confirms the reliability of both types of multi-wavelength retinal oximeters in detecting retinal oxygen saturation， providing evidence-based science for the clinical application of multi-wavelength retinal oximetry.

Graphical abstract

关键词

视网膜血氧饱和度 / 多波长视网膜血氧仪 / 巴马小猪

Key words

Retinal oxygen saturation / Multi-wavelength retinal oximeter / Bama mini pig

视网膜的完整结构和正常功能都离不开氧气供给，是人体代谢最活跃的组织之一^[1]。广泛分布的微血管直接参与组织细胞新陈代谢物质交换，为视网膜的正常生理活动提供充足的氧气^[2]。作为活体中唯一可以直接观察到的终末微血管，视网膜微血管是生物体微血管直接、无创观察的窗口^[3-4]。合适的氧气供应对视网膜活性和功能至关重要，氧气输送不足或氧气利用不充分都可能导致视网膜微血管疾病的发生，同时也可以作为其他全身代谢性疾病早期阶段的预警信号^[5-8]。因此，监测视网膜的氧气含量对于研究生物体的代谢功能具有重要意义。

血氧饱和度（SO₂）是指血液中氧合血红蛋白（HbO₂）占总血红蛋白（Hb）可能结合氧量的比例，反映血液中氧气的浓度，是评估生命体征的关键指标之一^[9-10]。临床上常用的血氧饱和度多指全身血氧饱和度，视网膜血氧饱和度使用较少。视网膜血氧饱和度是一个极为灵敏的测量指标，在病理条件下可显示出明显的改变，即使病变部位并不在眼部。

视网膜血氧仪器是对机体视网膜动静脉血管所含氧饱和度进行检测的一种无创方法^[11]。首先利用血液中氧合血红蛋白和还原血红蛋白吸收光谱特性的不同，采用特定波长光线对视网膜组织进行眼底照相，然后利用多波长视网膜血氧测定法分析来自视网膜血管反射的光线，结合计算机软件图像分析技术，即可定量进行视网膜血氧饱和度测量。本研究将在不同氧浓度下，采取不同方式检测巴马小猪的视网膜血氧饱和度，明确间接血氧仪检测与金标准直接检测的相关性及准确性。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

盐酸利多卡因滴眼液由四川禾亿制药有限公司提供，盐酸罗哌卡因注射液由济川药业集团有限公司提供，复方托吡卡胺滴眼液由沈阳兴齐眼药股份有限公司提供，加替沙星眼用凝胶由沈阳兴齐眼药股份有限公司提供，戊巴比妥钠由上海上药新亚药业有限公司提供，舒泰50（替来他明125 mg + 唑拉西泮125 mg）由法国维克有限公司(Virbac S.A.)提供，全价猪粉末饲料由四川中科奥格生物科技有限公司提供。

1.2 实验仪器

视网膜血管血氧饱和度测量仪（Oxymapehf.Hamrahlid，17-105Reykjavik–Iceland，冰岛雷克雅未克）（以下简称Ⅰ型），多波长结构功能耦合视网膜成像仪（ROSV-M18；Healthsun Vision，中国成都）（以下简称Ⅱ型），O₂微传感器（OX-25，Unisense，Aarhus），Clark型氧化还原微电极（OX-10，Unisense），血气分析仪（型号：i-STAT1便携式血气分析仪，美国雅培）。

1.3 实验动物

巴马小猪6只，均由四川中科奥格生物科技有限公司提供。3 ~ 4月龄，雌雄各半，SPF级，体重（25.00 ± 0.41） kg，结膜无充血，眼位正常，角膜透明，晶体无混浊，瞳孔直接和间接对光反射存在。饲养条件：保持室温18 ～ 22℃，相对湿度50％ ～ 70％，12 h/12 h明暗交替，通风换气良好，噪音在85分贝以下，自由摄食饮水。遵循ARVO关于实验动物使用和喂养的声明；严格按照国家相关规定保护实验动物的伦理及福利要求，遵守“减少、替代、优化”的“3R”原则，科学、合理、人道地使用实验动物。实验方案均经四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所伦理委员会审核批准（批号：伦审2024第008号）。

1.4 实验方法

1.4.1 巴马小猪干预

随机编号，适应性喂养1 w。麻醉后气管插管，分别吸入21%（正常氧）、100%（高氧）、10%（低氧）三种浓度的氧气1 h。通过心电监护仪监测，当外周脉搏氧饱和度达到稳定水平时，每只巴马小猪都要进行股动脉血气分析、玻璃体内血氧饱和度和视网膜血氧饱和度测定。每种方法检测6次，取平均值。

1.4.2 股动脉血气分析

巴马小猪大腿内侧腹股沟区域，触摸确定股动脉搏动位置后，注射器抽取血样1 mL，轻轻混匀，防止凝血。15 min内丢弃注射器头端2 ~ 3滴血，注入EG7⁺血气测试片，使用血气分析仪测定血气指标。

1.4.3 Ⅰ型视网膜血氧仪

Ⅰ型仪器使用570 nm等距波长和600 nm非等距波长进行测量，通过比较血管反射光强度和周围背景光强度来评估血管的光密度（optical density，OD），计算光密度比（optical density ratio，ODR）：

OD=\mathrm{l}\mathrm{o}\mathrm{g}\left(\frac{{\mathrm{I}}_{\mathrm{0}}}{\mathrm{I}}\right)

\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{R}=\frac{\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{600}}}{\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{570}}}

其中，Ⅰ₀是通过测试溶液前的光强度，Ⅰ是透射光强度；\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{600}}是600 nm波长处的光密度，\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{570}}是570 nm波长处的光密度。

ODR与血红蛋白的氧饱和度呈近似线性关系：

\mathrm{S}\mathrm{a}\mathrm{t}\mathrm{O}\mathrm{2}=\mathrm{a}+\mathrm{\kappa }\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{R}

其中a和k是常数，通过校准获得。

根据猪眼底的不同，调整软件算法中跟踪血管和选择入射光及反射光强度测量点。以视盘（3根主血管根部）为中心，以494像素为半径画第一个圆圈作为视盘边界，以988像素为半径画第二个圆圈，两个圆圈之间的血管作为血氧饱和度分析、研究区域。从颞侧开始顺时针依次标注，静脉分为颞上V、颞下V、鼻侧V，伴行动脉分为颞上A、颞下A、鼻侧A，见图1。

1.4.4 Ⅱ型视网膜血氧仪

该仪器同样使用570 nm等距波长和600 nm非等距波长进行测量。捕获图像后，将通过HIQA量化分析系统进行处理，利用氧合血红蛋白和还原血红蛋白在不同波长光下的吸收率差异（两者在570 nm波长下吸收率差异较小，在600 nm波长下吸收率差异较大）计算两个不同波长图像间的ODR，从而检测视网膜血管并据此计算视网膜血氧饱和度、血管直径、血管弯曲度等参数。

1.4.5 玻璃体内血氧饱和度

开睑器撑开眼球，间接检眼镜直视下，探针通过导管插入玻璃体，微型机械手推进，确定探头定位。将探针放置在视网膜上部最突出的主静脉上方0.5 mm处，见图2。通过O₂微传感器损伤性穿刺视网膜，检测计算得出动静脉区域的玻璃体内血氧饱和度值，每只小猪分别检测3根动脉和静脉。使用SEVERINGHAUS等^[12]开发的方程式[SO2 = (23,400 × (pO23 + 150 × pO2)-1 + 1)-1]计算每1个血氧饱和度值对应的氧分压值（该方程式不考虑在温度、pH值和DPG二磷酸甘油酸浓度下的差异）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0和R version 4.4.1软件进行统计分析。符合正态分布数据，使用ANOVA单因素方差分析比较多组间的差异^[13]；配对样本t检验比较2种检测方法之间的差异^[14]；拟合线性回归方程评估2种检测方法之间的变化关系。不符合正态分布数据，选用秩和检验进行统计分析。P < 0.05表示差异具有统计意义。

2 结果

2.1 股动脉血氧饱和度和玻璃体内血氧饱和度存在强相关性

最小二乘法拟合的线性回归分析结果显示，股动脉血氧饱和度与玻璃体内血氧饱和度存在正相关。当吸入氧浓度为10%时，y = 1.0063x + 4.5236，调整R2 = 0.914，线性回归模型差异有统计学意义（P < 0.05），见图3A。当吸入氧浓度为21%时，y = 0.8394x + 10.495，调整R2 = 0.7502，线性回归模型差异有统计学意义（P < 0.05），见图3B。当吸入氧浓度为100%时，y = 2.5379x - 153.87，调整R2 = 0.9051，线性回归模型差异有统计学意义（P < 0.05），见图3C。

2.2 Ⅰ型和Ⅱ型视网膜血氧仪检测视网膜动静脉血氧饱和度具有同样的准确性

在吸氧浓度分别为10%、21%和100%时，股动脉血气分析结果发现，随着吸入氧浓度的升高，股动脉血氧饱和度增加，差异有统计学意义（P < 0.05），见表1。比较两种视网膜血氧仪所测得视网膜动静脉血氧饱和度值以及动静脉血氧饱和度之差时发现，Ⅰ型与Ⅱ型视网膜血氧仪测得的血氧饱和度值均随着吸氧浓度的增加而增加，差异有统计学意义（P < 0.05）；Ⅰ型和Ⅱ型视网膜血氧仪在相同吸氧浓度下，动静脉血氧饱和度值以及动静脉血氧饱和度之差均无统计学意义（P > 0.05）。比较两种视网膜血氧仪所测得视网膜动静脉管径值时发现，在吸氧浓度为10%时，Ⅰ型、Ⅱ型视网膜血氧仪检测值有统计学意义（P < 0.05）；在吸氧浓度为21%和100%时，Ⅰ型、Ⅱ型视网膜血氧仪检测值无统计学意义（P > 0.05）。

2.3 玻璃体内动静脉血氧饱和度与视网膜动静脉血氧饱和度的线性关系

最小二乘法拟合的线性回归发现，在吸入氧浓度分别为10%、21%和100%时，玻璃体内动静脉血氧饱和度与视网膜动静脉血氧饱和度均随着吸氧浓度的增加而增加，差异均具有统计学意义（P > 0.05）。Ⅰ型、Ⅱ型视网膜血氧仪检测的动静脉血氧饱和度值分别与玻璃体内动静脉血氧饱和度值比较，差异均无统计学意义（P > 0.05），见图4、图5。

3 讨论

目前血氧饱和度检测技术分为有创和无创。有创检测技术包括两种，一种为采集动脉血通过血气分析仪检测外周血氧饱和度，这种方式检测精确度高，但存在缺乏连续性和即时性、操作复杂、受试者痛苦等弊端；另一种为血氧探头放置体内器官或组织内检测局部血氧饱和度，是一种新型检测手段^[15-16]。本研究结果显示，在三个不同吸氧浓度下，股动脉血氧饱和度与玻璃体内血氧饱和度存在线性关系（P < 0.05），股动脉血氧饱和度增加，玻璃体内血氧饱和度随之增加。

无创检测技术包括两种，一种为脉搏血氧测定法，此方法可以实现连续测量，无创且使用便捷，但无法检测到高氧和低氧血症，且对于肤色较深、低灌注、涂凝胶指甲油的患者检测结果精确度差^[17]；另一种为无创多波长视网膜血氧检测法，此方法对局部和全身血氧饱和度的变化都很敏感^[18]。既往研究表明，在艾森曼格综合征^[19]和慢性阻塞性肺疾病^[20]引起的全身低氧血症中以及在诱导健康受试者的全身氧饱和度变化期间，全身血氧饱和度与视网膜血氧饱和度之间存在显著相关性。

人体血氧饱和度小于90%时，氧分压常小于60 mmHg，有发生低氧血症的风险，麻醉时可能发生全身麻醉诱导后低血压（post-induction hypotension，PIH）^[21-22]，使用巴马小猪进行实验还可以在比人体更大的全身血氧饱和度范围内测量血氧饱和度。既往研究证明，猪在清醒状态下的氧含量低于人类，这是由人和猪氧合血红蛋白解离曲线的差异确定的^[23]。与人类氧合血红蛋白解离曲线相比，猪的氧合血红蛋白解离曲线向右移动，导致人和猪在相同pO2下的血氧饱和度差异明显。10%吸氧浓度下股动脉血气测量，平均差异为9.37%；21%吸氧浓度下股动脉血气测量，平均差异为1.17%； 100% 吸氧浓度下股动脉血气测量，平均差异为1.05%。与人类受试者的视网膜血氧饱和度值相比，猪的视网膜血氧饱和度表现出较高的个体内变异性，总体视网膜血氧饱和度较低，这可能是由于猪眼前后轴较短，具有一定程度的角膜散光，与人类光学特性不同，因此难以在猪视网膜上获得均匀聚焦^[24]。

正常猪眼视网膜血管管径值的报道很少。JEPPESEN等^[25]的研究表明，猪眼的一级视网膜动脉直径约为140 µm。然而健康人类受试者的一级视网膜动脉直径约为120 µm，这表明猪视网膜动脉并不明显大于人类视网膜动脉，观察到的差异可能是由于放大倍率不同^[26]。

注视角度不同，拍摄图像时得到同一血管节段的管径值也不同。猪的眼底摄像通常需要倾斜眼底相机并以较高的角度拍摄图像，此时血管位置相比注视前方向下移动，测量的管径值也会有所差异。猪的主要视网膜血管位于视网膜浅层，而人类的视网膜血管会更深地嵌入神经纤维层，这可能会导致入射光和透射光路径不一致，测得管径值也就不同^[27-28]。PALKOVITS等^[29]测量得出，与基线21%氧气浓度相比，人类健康受试者在100%氧气浓度呼吸过程中血管直径减小。同样的，本实验中两种仪器在100%氧气浓度下测量的动静脉管径均小于在21%氧气浓度下测量的动静脉管径，这也与TRAUSTASON等^[30]研究结果一致。

黑色素沉积会影响血氧饱和度测量精确度^[31]。两种仪器研发之初，标定实验中的实验对象人种不同，其中Ⅰ型实验对象为白种人，Ⅱ型实验对象为黄种人。不同人种间虹膜细胞中黑色素含量和眼底黑色素含量有明显差异，而黑色素具有依赖波长的光吸收和散射特性。在相同波长的照明光下，不同个体视网膜背景的后向散射光子受到的影响不同，这会导致光密度和血氧饱和度的测量出现误差，因此研究人员开发出相应的算法校正误差以减少色素差异导致的氧饱和度测量变异性^[32-33]。统一校正公式，须排除不同人种对血氧饱和度测量的影响。

本研究中使用的吸氧浓度梯度与 BEACH 等^[34]在 1999 年对人类受试者使用的水平（常氧21%和高氧100%）相比，增加了低氧10%，结果显示股动脉血氧饱和度显著降低。本研究中，两种视网膜血氧仪测量常氧下的动静脉血氧饱和度差异均远高于低氧和高氧，可能是因为：在10%吸氧浓度下，由于氧气总量有限，视网膜动脉血氧饱和度不会超过一定极限值；在100%吸氧浓度下，由于血氧饱和度不会超过100%，动脉血氧饱和度呈现小幅度上升，静脉血氧饱和度大幅度升高，因此低氧和高氧下动静脉血氧饱和度差异小。此外，在10%吸氧浓度下，两种视网膜血氧仪测得动静脉管径有差异（P < 0.05）；在21%和100%吸氧浓度下，两种视网膜血氧仪测得动静脉管径无差异（P > 0.05）。

不同氧浓度下，玻璃体内动静脉血氧饱和度值与两种视网膜血氧仪所测得视网膜动静脉血氧饱和度值统计分析和比较，结果均呈近似线性关系，说明玻璃体内血氧饱和度与视网膜血氧饱和度呈正相关，玻璃体内血氧饱和度增加，视网膜血氧饱和度随之增加。同时，将Ⅰ型与Ⅱ型视网膜血氧仪测得值进行比较，二者基本吻合，说明两种视网膜血氧仪精确度相似。

既往研究表明，舒泰是由替他来明和唑拉西泮按照重量比1∶1混合而成，其中替他来明属兽用麻醉剂，唑拉西泮属苯二氮卓类药物，作用于γ-氨基丁酸A受体发挥镇静催眠作用^[35]。舒泰麻醉诱导平稳、迅速，有良好的镇静、肌松作用，能影响机体心率、体温、血压等生理指标，但对血氧饱和度没有影响^[36]。因此在麻醉期间，不太可能对我们的结果产生影响。

4 结论

多波长视网膜血氧测定法对巴马小猪全身血氧饱和度变化较敏感。Ⅰ型、Ⅱ型视网膜血氧仪精确度一致。本实验填补了不同手段测量视网膜血氧饱和度的空白，明确了两种多波长视网膜血氧仪检测视网膜血氧饱和度的可靠性，为人类疾病的预测、诊断、疗效评价等提供了有价值的实验依据。

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基金资助

国家自然科学基金项目(8247155561)