血根碱通过激活LKB1/AMPK/SIRT1通路抑制内质网应激和细胞衰老以改善骨关节炎

Sanguinarine Inhibits Endoplasmic Reticulum Stress and Cell Senescence through Activation of the LKB1/AMPK/SIRT1 Pathway to Ameliorate Osteoarthritis

摘要

目的 研究血根碱（sanguinarine，SG）在骨关节炎（osteoarthritis，OA）进展中的作用，并探讨其可能机制。 方法 分离原代小鼠膝关节软骨细胞，分为SG、叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide，TBHP）、TBHP + SG、TBHP + SG + 毒胡萝卜素（thapsigargin，TG）、TBHP + SG + 肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）siRNA组。利用CCK-8、流式细胞术、DCFH-DA探针、β针半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）染色分别检测细胞活力、凋亡、活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平和β-gal活性。利用RT-qPCR和Western blotting检测衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）的mRNA水平和LKB1/AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/去乙酰化酶1（sirtuin 1，SIRT1）通路相关蛋白表达。将小鼠分为Sham、Sham + SG（1.25 μM，10 μL）、OA、OA + SG（0.8/1.25 μM，10 μL）组，利用番红O-固绿和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）染色评估软骨丢失和凋亡情况。 结果 浓度筛选显示SG处理软骨细胞的最适浓度为1.25 μM。SG处理可逆转TBHP诱导的细胞活力下降，细胞凋亡、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解、ROS生成、衰老相关蛋白［如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，p21）和周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，p16）］表达、SASP［如单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP3）、C-X-C基序趋化因子配体10（C-X-C motif chemokine ligand 10，Cxcl10）］mRNA表达以及β-gal活性升高。TG处理可逆转上述改变。SG处理有效中和TBHP诱导的内质网（endoplasmic reticulum，ER）应激相关蛋白［如葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78 kD， GRP78）和C/EBP同源蛋白（C/EBP Homologous Protein，CHOP）］表达上调以及LKB1和AMPK磷酸化水平和SIRT1蛋白水平降低。沉默LKB1可抵抗SG对ER应激的抑制作用，表明SG通过调控LKB1/AMPK/SIRT1通路抑制TBHP诱导的ER应激。在体内，SG以剂量依赖方式减轻OA小鼠的软骨细胞凋亡和软骨丢失。 结论 血根碱通过激活LKB1/AMPK/SIRT1信号通路抑制ER应激，从而缓解氧化应激诱导的软骨细胞ECM降解、凋亡和衰老，阻碍小鼠OA进展，为OA治疗提供了新的理论依据。

Abstract

Objective The aim of this study was to investigate the role of Sanguinarine （SG） in the progression of osteoarthritis （OA） and to elucidate the possible mechanisms involved. Methods Primary mouse knee articular chondrocytes were isolated and treated with SG， tert-butyl hydroperoxide （TBHP）， TBHP+SG， TBHP+SG+ thapsigargin （TG）， or TBHP+SG+ liver kinase B1 （LKB1） siRNA. Cell viability， apoptosis， ROS level and β-gal activity were detected by CCK-8， flow cytometry， DCFH-DA probe and β-galactosidase （β-gal） staining， respectively. The mRNA levels of senescence-associated secretory phenotype （SASP） was detected by RT-qPCR and LKB1/ AMP-activated protein kinase （AMPK）/sirtuin 1 （SIRT1） pathway related protein expressions were measured by Western blotting. Mice were divided into： the Sham group， the Sham+SG （1.25 μM， 10 μL） group， the OA group， and the OA+SG （0.8/1.25 μM， 10 μL） group， and cartilage loss and apoptosis were assessed using safranin O-fast green and TUNEL staining. Results Concentration screening showed that the optimal concentration for SG treatment of chondrocytes was 1.25 μM. SG treatment reversed the TBHP-induced decrease in cell viability， and increase in apoptosis， ECM degradation， ROS generation， expression of senescence-associated proteins （such as cyclin dependent kinase inhibitor 1A （p21） and cyclin dependent kinase inhibitor 2A （p16））， mRNA expression of SASPs （such as monocyte chemoattractant protein-1 （MCP-1）， matrix metalloproteinase 3 （MMP3）， and C-X-C motif chemokine ligand 10（Cxcl10）， and β-gal activity. TG treatment could reverse the above changes. SG treatment effectively neutralized the TBHP-induced up-regulation of ER stress-related proteins （such as glucose regulated protein 78kD （GRP78） and C/EBP Homologous Protein （CHOP）） and reduced phosphorylation levels of LKB1 and AMPK and protein level of SIRT1. Silencing of LKB1 resisted the inhibitory effect of SG on ER stress， suggesting that SG inhibited TBHP-induced ER stress by modulating the LKB1/AMPK/SIRT1 pathway. In vivo， SG administration attenuated chondrocyte apoptosis and cartilage loss in OA mice in a dose-dependent manner. Conclusion Sanguinarine inhibited endoplasmic reticulum stress by activating the LKB1/AMPK/SIRT1 signaling pathway， thereby alleviating ECM degradation， apoptosis， and senescence of chondrocytes induced by oxidative stress， and hindering the progression of osteoarthritis （OA） in mice，and providing a new theoretical basis for the treatment of OA.

Graphical abstract

关键词

血根碱 / LKB1/AMPK/SIRT1通路 / ER应激 / 衰老 / 软骨细胞

Key words

Sanguinarine / The LKB1/AMPK/SIRT1 pathway / Endoplasmic reticulum stress / Cell senescence / Chondrocytes

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种主要影响老年人的慢性退行性关节疾病，以关节软骨结构破坏和功能障碍为标志性特征^[1]，临床出现慢性疼痛，甚至致残，可导致较大的社会经济负担^[2]。软骨细胞是关节软骨中一种独特的细胞类型，若出现细胞凋亡、衰老和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解增加等功能障碍时，可促进OA的发生与进展^[3]。研究显示，软骨细胞衰老是OA发生的重要病理过程^[4]。衰老一般由机体氧化损伤引发，并产生异常炎症环境^[5]，但软骨细胞衰老的潜在机制尚未阐明。

内质网（endoplasmic reticulum，ER）应激由ER中未折叠或错误折叠蛋白的负荷与ER处理能力之间的不平衡导致，参与了许多疾病的病理进程^[6]。最近研究表明，软骨细胞中的ER应激是软骨细胞凋亡和OA进展的诱因^[7]。此外，过量的氧化应激可触发ER应激，并破坏软骨的动态平衡，导致软骨细胞损伤^[8]。血根碱（sanguinarine，SG）是一种植物源性生物碱，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗血小板和抗高血压等多种药理作用^[9]，并具有低毒、低耐药性和无环境污染的优点^[10]。血根碱可激活AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）通路，还可通过抑制分解代谢蛋白酶的表达抑制OA的进展^[11]。AMPK-去乙酰化酶1（sirtuin 1，SIRT1）信号通路活性增强可减缓OA的发展^[12]，提示血根碱可能通过调控 AMPK/SIRT1信号通路参与OA进展。肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）是AMPK的上游激酶。据报道，白藜芦醇通过激活PKA/LKB1/AMPK通路减轻线粒体功能障碍和氧化应激，改善高脂饮食诱导的老年大鼠肌肉萎缩^[13]，提示LKB1/AMPK通路是调控氧化应激的关键机制。此外，激活LKB1/AMPK/SIRT1通路可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞ER应激^[14]。本研究拟探究SG是否通过激活LKB1/AMPK/SIRT1通路抑制ER应激和细胞衰老，从而缓解骨关节炎，为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与药物

SG（纯度 ≥ 98%，abs47006424）购自Absin（上海，中国）；叔丁基过氧化氢（Tert-butyl hydroperoxide, TBHP; 458139）、Thapsigargin（TG，586006）、DAPI（D9542）、胶原酶Ⅱ（1148090）购自Sigma-Aldrich（美国）；0.25%胰蛋白酶（15050065）和胎牛血清（FBS，A5670801）购自Gibco（美国）；DMEM/F12培养基（SH30023.01）、磷酸盐缓冲液[（phosphate buffered saline，PBS），BSS-PBS-1X6]购自HyClone（美国）；TRIzol试剂（15596018CN）购自Invitrogen（美国）；cDNA synthesis kit（6210A）、SYBR Premix Ex Taq试剂盒（DRR420A）购自TaKaRa（大连，中国）、衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）染色试剂盒（C0602）、RIPA裂解缓冲液（P0013B）、BCA蛋白质测定试剂盒（P0010S）购自Beyotime（上海，中国）、聚偏二氟乙烯膜（22860）购自Thermo Fisher（美国）；Novex™ ECL（WP20005）购自Invitrogen（美国）；原位细胞死亡检测试剂盒（ab206386）购自Abcam（美国）；改良番红O-固绿软骨染色试剂盒（G1371）购自索莱宝（北京，中国）。

1.2 仪器

酶标仪（BioTek Epoch 2）购自Bio-Tek（美国）、荧光显微镜（BX53）和光学显微镜（CX43）购自Olympus（日本）、高速冷冻离心机（MicroCL 17R）和CO₂细胞恒温培养箱（Forma Steri-Cult）购自Thermo Scientific（美国）。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠原代软骨细胞的分离和培养

对SPF级出生7 d的C57BL/6J小鼠（6只，4 ~ 6 g/只，雄∶雌 = 1∶1）经腹腔注射2%（w/v）戊巴比妥（200 mg/kg）麻醉致死后，无菌分离关节软骨，经胰蛋白酶（0.25%，1 h）和胶原酶Ⅱ（0.2%，37 ℃，4 h）消化获得原代软骨细胞。细胞培养于含10% FBS和1%链青霉素的DMEM/F12培养基中，经CollagenⅡ免疫荧光鉴定，取第2 ~ 3代细胞用于实验。

1.3.2 细胞处理

根据操作指南利用lipofectamine 3000试剂将NC siRNA（100 nM）或LKB1 siRNA（100 nM）转染到软骨细胞中。细胞分组如表1所示。

1.3.3 细胞活力

将处理后的软骨细胞（5 × 10³/孔）接种于96孔板过夜培养，随后在指定时间点加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育2 h，检测450 nm吸光度值。

1.3.4 活性氧水平检测

软骨细胞（3 × 10⁵/孔）接种于6孔板，处理24 h后与10 μM二氯二氢荧光素二乙酸酯（2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）荧光探针避光孵育30 min（37 ℃），荧光显微镜观察结果。

1.3.5 实时荧光定量PCR

采用TRIzol法提取总RNA后，取1 μg逆转录为cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒在ABI 7500系统中进行qPCR。以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt法分析基因表达。

1.3.6 Western blot实验

采用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白后，通过BCA法进行蛋白定量，取40 μg蛋白经SDS-PAGE电泳分离并转印至PVDF膜。随后用5%脱脂牛奶封闭2 h，先后与一抗（4 ℃过夜）和二抗（室温2 h）孵育，TBST洗涤3次后采用ECL显色，最后使用Image J软件对蛋白条带进行定量分析。

1.3.7 SA-β-gal染色

采用SA-β-gal染色检测细胞衰老。将小鼠软骨细胞接种于24孔板，处理后用4%多聚甲醛固定10 min，SA-β-gal染色液37 ℃孵育过夜，显微镜下随机拍摄并利用Image J定量分析。

1.3.8 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记染色

采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）染色检测软骨细胞凋亡。细胞经4%多聚甲醛固定15 min后，PBS洗涤3次，0.1% Triton X-100透化3 min，原位细胞死亡检测试剂盒染色，DAPI复染核，荧光显微镜观察并拍照分析。

1.3.9 小鼠OA模型构建和给药程序

40只12周龄雄性C57BL/6J小鼠（20 ~ 26 g/只，购自中国科学院上海动物中心）随机分为5组：假手术（Sham）、Sham + SG（1.25 μM，10 μL）、OA、OA + SG（0.8 μM，10 μL）和OA + SG（1.25 μM，10 μL）。通过DMM手术建立OA模型^[15] （假手术组仅切开关节），术后10 d向Sham组或OA组小鼠关节腔注射血根碱（每周2次）。6周后，解剖各组小鼠的股骨和胫骨用于组织学评估。

1.3.10 组织学分析

小鼠膝关节经4%（v/v）多聚甲醛固定24 h后，用10%（v/v）EDTA脱钙1个月，石蜡包埋后制备5 μm矢状切片。采用番红O-固绿染色，并采用国际骨关节炎研究学会（Osteoarthritis Research Society International，OARSI）评分系统进行软骨形态学评估^[16]。切片经脱蜡、水合、Triton X-100（0.1%）透化后，利用TUNEL染色检测细胞凋亡。所有切片由盲法观察者进行定量分析。本研究中动物实验方案经河南省中医院（河南中医药大学第二附属医院）伦理委员会批准（批号：202303012）。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，符合正态性的计量数据采用均数 ± 标准差(\overline{x} ± s)表示。采用单因素方差分析进行多组间比较，事后多重比较采用Tukey检验。P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血根碱的剂量筛选

1.25 μM血根碱处理24和48 h对软骨细胞活力无显著影响，而2.5 ~ 20 μM浓度则呈剂量依赖性抑制细胞活力，见图1A、1B。故后续实验选用1.25 μM血根碱。

2.2 血根碱处理缓解TBHP诱导的软骨细胞衰老

与对照组相比，50 μM TBHP会显著抑制软骨细胞活力并促进ROS生成，而血根碱可逆转这些效应。TBHP还能增强β-gal活性、上调p16/p21蛋白及SASP（包括MCP-1、MMP3、Cxcl10）的mRNA水平诱导细胞衰老，血根碱则有效抑制上述衰老表型。见图2。

2.3 血根碱处理缓解TBHP诱导的软骨细胞凋亡和细胞外基质降解

TBHP显著增加软骨细胞凋亡，并上调cleaved-caspase-3 / Bax表达、下调Bcl-2表达，见图3A-3D。TBHP通过降低CollagenⅡ/Aggrecan并升高ADAMTS5促进ECM降解，血根碱可缓解这一过程，见图3E、3F。

2.4 血根碱处理缓解TBHP诱导的软骨细胞内质网应激

TBHP显著激活软骨细胞ER应激，上调磷酸化形式的PERK和eIF2α、GRP78和CHOP的蛋白表达；而血根碱处理可有效抑制这些ER应激标志蛋白的表达，缓解TBHP诱导的应激反应，见图4。

2.5 血根碱通过抑制TBHP诱导的ER应激抑制软骨细胞衰老

血根碱显著抑制TBHP诱导的ER应激（降低p-PERK、p-eIF2α、GRP78和CHOP），而thapsigargin（TG，ER应激激活剂）处理可逆转这一作用，见图5A、5B。同时，血根碱提升细胞活力、降低ROS水平及衰老指标，TG则抵消其保护效应，见图5C-5H。

2.6 血根碱通过抑制TBHP诱导的ER应激抑制软骨细胞凋亡和ECM降解

血根碱显著减少TBHP诱导的软骨细胞凋亡（降低TUNEL阳性率及cleaved-caspase-3/Bax表达，提升Bcl-2表达），并缓解ECM降解（增加CollagenⅡ/Aggrecan表达，减少ADAMTS5表达）；而TG可完全逆转这些保护作用，见图6。

2.7 血根碱通过激活LKB1/AMPK/SIRT1通路抑制TBHP诱导的ER应激

血根碱通过上调p-LKB1/p-AMPKα/SIRT1蛋白水平缓解TBHP诱导的LKB1/AMPK/SIRT1通路抑制；而LKB1 siRNA转染通过抑制p-LKB1/p-AMPK/SIRT1的蛋白水平阻断该通路，并通过上调p-PERK/p-eIF2α/GRP78/CHOP表达加剧ER应激，见图7。

2.8 血根碱给药可抑制小鼠OA进展

与Sham比较，OA小鼠关节软骨表面被侵蚀，大量蛋白聚糖丢失，软骨细胞数量减少，OARSI评分较高；血根碱以剂量依赖性方式减轻软骨损伤和降低OARSI评分，见图8A、8B。OA小鼠TUNEL阳性细胞比例更高，血根碱给药以剂量依赖方式抑制细胞凋亡,见图8C、8D。OA小鼠软骨组织中LKB1/AMPK/SIRT1通路活性被显著抑制，cleaved-caspase-3/CHOP蛋白水平和SASP mRNA水平显著上调，这被血根碱给药以剂量依赖性方式逆转,见图8E-8I。1.25 μM血根碱给药对Sham组小鼠各项指标均无显著影响，见图8。

3 讨论

骨关节炎是一种常见的衰老相关疾病，其特征是关节软骨的逐渐退化^[17]。目前OA治疗主要局限于疼痛管理，且无有效的疾病缓解疗法，导致疾病进展至后期需进行关节置换术^[1]。因此，在疾病早期采取有效的方法抑制关节软骨退变至关重要。

本研究旨在探讨氧化应激对软骨细胞衰老的影响及其在OA发病中的作用。本研究证实TBHP诱导软骨细胞衰老，表现为ROS累积、SA-β-gal活性增强及p16/p21表达上调，同时伴随SASP因子分泌增加和ECM降解。此外，TBHP还可促进软骨细胞凋亡。既往研究表明，软骨细胞衰老是OA发病的关键环节，其可由氧化损伤触发，通过分泌SASP因子与周围细胞相互作用在OA进展中形成促炎微环境，并抑制ECM合成^[18-19]。老年人和OA患者关节软骨中普遍存在SA-β-gal活性增强以及p16和p21表达升高等衰老特征^[4]。本研究进一步证实氧化应激诱导的细胞衰老通过促炎微环境和基质代谢失衡加剧软骨退变。

本研究探讨了氧化应激诱导的ER应激在OA软骨细胞损伤中的作用机制。我们发现TBHP显著上调ER应激标志蛋白的表达，表明氧化应激可有效激活软骨细胞ER应激反应。ER应激条件下，未折叠蛋白反应被激活，GRP78表达上调并激活ATF6、IRE1α和PERK信号通路。持续应激最终引发CHOP介导的细胞凋亡^[6]。软骨细胞ER应激是导致软骨细胞凋亡的重要机制^[7]。在OA治疗方面，研究显示西洋参皂苷和牛磺酸可通过抑制ER应激减轻软骨细胞凋亡^[20-21]。此外，氧化应激也可通过触发ER应激破坏软骨稳态，导致软骨细胞损伤和凋亡^[8]。本研究进一步证实，氧化应激诱导的ER应激是连接氧化损伤与软骨细胞损伤的重要病理环节。

本研究通过体外实验发现，血根碱能够显著缓解TBHP诱导的软骨细胞氧化应激、细胞衰老、ECM降解、细胞凋亡和ER应激。机制研究表明，ER应激激活剂可拮抗血根碱的软骨保护作用，证实血根碱主要通过抑制ER应激途径来减轻软骨细胞损伤。此外，动物实验结果显示，血根碱给药可有效缓解OA小鼠的软骨退变。这些发现与近年来关于中草药抗OA作用的研究成果相呼应。多项研究表明，中草药因其显著的疗效和较低的毒性在OA治疗中展现出重要价值^{[15-16, 22]}。最近研究发现，血根碱通过抑制分解代谢蛋白酶的表达延缓OA进展^[11]。本研究进一步揭示了血根碱通过调控ER应激发挥软骨保护作用的新机制，不仅丰富了中草药治疗OA的理论基础，也为OA的临床治疗提供了潜在的药物选择。

本研究探讨了血根碱通过LKB1/AMPK/SIRT1信号通路调控软骨细胞能量代谢和ER应激的作用机制。本研究发现TBHP抑制软骨细胞中LKB1/AMPK/SIRT1通路活性，血根碱则有效激活该通路。LKB1沉默逆转血根碱的ER应激抑制作用，表明血根碱通过LKB1/AMPK/SIRT1通路发挥保护作用。这些发现与能量代谢在软骨稳态中的关键作用相吻合。此外，软骨细胞的自我更新和ECM合成高度依赖能量代谢^[23]。AMPK是能量代谢的核心调节因子，AMPK/SIRT1通路对维持软骨稳态至关重要，其缺失会加剧OA进展^[24-25]。LKB1是AMPK上游激酶，LKB1/AMPK/SIRT1通路抑制ER应激的作用在心血管疾病中被证实^[14]。血根碱已被报道是AMPK的变构激活剂。

4 结论

血根碱通过激活LKB1/AMPK/SIRT1信号通路抑制ER应激，从而缓解氧化应激诱导的软骨细胞ECM降解、凋亡和衰老，阻碍小鼠OA进展，为OA治疗提供了新的理论依据。

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基金资助

河南省中医药科学研究专项(20⁃21ZY3013)