肠道微生态在母乳改善早产儿支气管肺发育不良中的作用

The Role of Intestinal Microecology in the Improvement of Bronchopulmonary Dysplasia by Breast Milk

摘要

目的 基于肺与大肠相表里理论，从肠道微生态角度探索母乳喂养防治早产儿支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）作用机制。 方法 选择2021年7月至2023年6月在西南医科大学附属中医医院新生儿科住院的98例早产儿作为研究对象，按生后28 d内主要喂养方式分为母乳喂养组和配方奶喂养组。观察两组早产儿BPD及其他并发症的发生率，采集早产儿生后3、7、14、28 d，以及出院前1 d的粪便样本进行肠道菌群检测。 结果 两组患儿并发症比较，差异无统计学意义（P > 0.05），但母乳喂养组患儿的支气管肺发育不良、坏死性小肠结肠炎、晚发型败血症发生率均低于配方奶喂养组；两组肠道菌群Alpha多样性（chao指数）比较，母乳喂养组高于配方奶喂养组，差异有统计学意义（P < 0.05）；母乳喂养组的肠杆菌、月形单胞菌、假单胞菌平均相对丰度高于配方奶喂养组，其余物种低于配方奶喂养组，两组肠杆菌、月形单胞菌、双歧杆菌比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 母乳喂养通过调节肠道微生物群，进一步对肺部菌群产生影响，从而降低早产儿BPD的发生。

Abstract

Objective The aim of this study was to explore the mechanism of breast feeding in the prevention and treatment of bronchopulmonary dysplasia in preterm infants from the perspective of intestinal microecology， based on the surface-inside theory of lung and large intestine. Methods A total of 98 preterm infants who were hospitalized in the Department of Neonatology of the affiliated traditional chinese medicine hospital of southwest medical university from July 2021 to June 2023 were enrolled. They were divided into the breastfeeding group and the formula feeding group according to feeding methods. The incidence of bronchopulmonary dysplasia and other complications were observed in the two groups. Fecal samples were collected on the 3rd， 14th， 28th day after birth and the day before discharge for intestinal flora detection. Results There were no significant differences in complications between the two groups （P > 0.05）， but the breastfeeding group had significantly lower incidence rates of bronchopulmonary dysplasia， necrotizing enterocolitis， and late-onset sepsis than the formula feeding group. The Alpha diversity （chao index） of intestinal flora in the breastfeeding group was higher than that in the formula feeding group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. The average relative abundance of Enterobacter， Firmicutes， and Pseudomonas in the breastfeeding group was higher than that in the formula feeding group， while the average relative abundance of the remaining species was lower than that in the formula feeding group. There were significant differences in the average relative abundance of Enterobacter， Firmicutes， and Bifido bacterium （P < 0.05）. Conclusions Breastfeeding reduces the incidence of bronchopulmonary dysplasia in preterm infants by regulating gut microbiota， which in turn affects the lung microbiota.

Graphical abstract

关键词

肺与大肠相表里 / 肠道菌群 / 支气管肺发育不良 / 早产儿 / 母乳

Key words

Interior-exterior relationship between lung and large intestine / Gut microbiota / Bronchopulmonary dysplasia / Premature infants / Breast milk

支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早产儿最常见的一种慢性肺部疾病。随着围产医学技术的进步，我国早产儿存活率明显上升，也导致BPD的发生率相应增高^[1]。既往研究显示，胎龄小于32周的早产儿发生BPD的概率为12.9% ～ 41%^[2]。若早产儿并发BPD，会导致其住院时间延长，同时并发症发生率及病死率增高，对患儿健康造成严重影响，也加重了家庭和社会负担。目前认为BPD是多种混合因素所致，发病机制尚不明确，目前主要应用肺泡表面活性物质、抗氧化剂、营养支持、维生素A、糖皮质激素等进行防治^[3]，但仍然缺乏有共识的治疗方法。近几年有研究发现，母乳喂养在降低BPD发生率方面可以起到一定的作用^[4]。

中医“从肠治肺”应用广泛，临床疗效较好^[5]。《黄帝内经》提及“肺与大肠相表里”，即肺与大肠一表一里，相互联系，相互影响，互为互用（肠病治肺、肺病治肠与肺肠合治）^[5]。越来越多的研究证实，肠道菌群与肺部疾病密切关联^[6]。因此，本研究在中医“肺与大肠相表里”理论指导下，应用16S扩增子测序技术，探索母乳喂养在防治BPD发生与发展方面的作用，以及肺部与肠道微生态相互影响的机制，拟为从肠道菌群角度研究BPD的防治，提供新的研究思路。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选择西南医科大学附属中医医院新生儿科2021年7月至2023年6月收治的98例早产儿为研究对象。纳入标准：①胎龄 < 32周的早产儿；②出生24 h内入住新生儿科；③无染色体异常、遗传代谢性疾病；④患儿家属知情同意，并签署同意书。排除标准：①膈疝合并肺发育不良、严重心血管畸形等；②放弃治疗及转院治疗者。本研究通过西南医科大学附属中医医院伦理委员会审核批准（批号：KY2021021-FS01）。

BPD诊断标准：出生胎龄 < 32周的早产儿在校正胎龄36周时仍依赖不同程度的FiO₂和呼吸支持手段 ≥ 3 d，并且有影像学资料证实存在肺间质病变^[7]。并参照2018年Rosemary标准，根据早产儿吸氧浓度和给氧方式将BPD分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级^[7]。

1.2 样本量估算

本研究采用Medsci样本量工具（Medsci sample size tool, MSST）进行优效性检验。根据文献^[4]，配方奶组BPD发生率为35%，预期母乳喂养组发生率为12%，优效性界值Δ = 23%。设定单侧α = 0.05、检验效能80%，计算得每组需49例，总样本量98例。研究通过严格入排标准及强化随访控制脱落风险，同类研究提示脱落率通常低于5%，因此未额外扩大样本量。

1.3 分组与喂养方法

1.3.1 分组方法

按生后28 d内主要喂养方式进行分组，能满足纯母乳喂养或部分母乳喂养者入母乳喂养组；完全给予早产儿配方奶喂养者入配方奶喂养组。

1.3.2 喂养方法

遵循早产儿标准化的喂养方案，生后24 h内开始微量肠内喂养。母乳喂养组在喂养量达到60 mL/（kg·d）时半量强化，达到100 mL/（kg·d）时足量强化，达到120 mL/（kg·d）时停止补充肠外营养^[8]。配制方法：半量强化为母乳25 mL加入0.5 g母乳营养补充剂（FM85）；全量强化为母乳25 mL加入1 g母乳营养补充剂（FM85）。配方奶喂养组使用早产儿配方奶。视其喂养耐受情况添加奶量，若发生喂养不耐受，遵医嘱予减少奶量或禁食，好转后继续常规喂养。

1.4 观察指标

本研究主要观察指标包括：①观察各组早产儿在校正胎龄36周时的BPD发生率。②肠道菌群差异性。次要指标为其他并发症发生率：包括住院期间坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）发生率和生活72 h至出院期间晚发型败血症（late-onset sepsis,LOS）发生率。

1.5 样本采集与检测方法

标本采集：采集早产儿生后3、7、14、28 d，以及出院前1 d的粪便标本，及时装入粪便收集管，并立即放入- 80℃超低温冰箱保存，然后采用干冰运输寄送至第三方检测机构进行检测。

16S扩增子测序技术流程：取基因组DNA样品30 ng与对应的融合引物，通过PCR扩增完成建库，文库质量检测，上机测序，下机数据过滤，reads拼接Tags，Tags聚类成OTU，然后与数据库比对、物种注释，做组间物种差异分析^[9]。采用Chao指数来度量肠道菌群阿尔法（Alpha）多样性，Chao指数反映物种丰富度。

1.6 统计学方法

采用SPSS 27.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数 ± 标准差（\overline{x}\pm s）表示，组间比较采用独立样本t检验；偏态分布的计量资料以中位数M（P₂₅，P₇₅ ）表示，两样本间比较采用秩和检验。组内多时间点比较采用重复测量方差分析（数据满足球形检验时）或Friedman 检验，事后两两比较经Bonferroni 校正。计数资料以例数/率n（%）表示，组间比较采用卡方检验。P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患儿一般资料比较

因3例患儿自动离院，最终95例早产儿纳入本研究，母乳喂养组/配方奶喂养组患儿比为49/46。两组早产儿的胎龄、性别、出生体重、身长和头围、分娩方式等进行比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见表1。

2.2 两组患儿住院期间并发症发生情况比较

两组患儿住院期间并发症比较，差异无统计学意义（P > 0.05），但母乳喂养组患儿的BPD、NEC、LOS发生率均低于配方奶喂养组，见表2。两组患儿BPD严重程度比较，差异无统计学意义（P > 0.05），但母乳喂养组患儿BPD严重程度低于配方奶喂养组，见表3。

2.3 操作分类单元聚类

2.3.1 OTU统计分析

母乳喂养组和配方奶喂养组共有的操作分类单元（Operational Taxonomic Unit，OTU）为1 020个，母乳喂养组特有的OTU 567个，配方奶喂养组特有的OTU 152个，见图1。

2.3.2 Alpha多样性分析

两组患儿chao指数间差异具有统计学意义（P < 0.05），其中母乳喂养组高于配方奶喂养组，见图2A。母乳喂养组生后3、7、14、28 d以及出院前1 d的chao指数比较，差异有统计学意义（P < 0.05），见图2B；配方奶喂养组生后3、7、14、28 d以及出院前1 d的chao指数比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见图2C。

2.3.3 物种分析

2.3.3.1 物种组成

从目水平物种组成统计结果来看，相对丰度最高的是肠杆菌（Enterobacteriales）和乳杆菌（Lactobacillales），其中母乳喂养组肠杆菌占40.03%，乳杆菌占17.11%；配方奶喂养组肠杆菌占29.13%，乳杆菌占25.15%。见图3。

2.3.3.2 关键物种差异比较

两组丰度前10的物种中，母乳喂养组的肠杆菌（Enterobacteriales）、月形单胞菌（Selenomonadales）、假单胞菌（Pseudomonadales）平均相对丰度（40.01%、4.32%、4.64%）高于配方奶喂养组的（29.11%、3.33%、0.37%），其余物种平均相对丰度低于配方奶喂养组；两组肠杆菌、月形单胞菌、双歧杆菌（Bifidobacteriales）平均相对丰度比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；其余物种比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见图4。

2.3.3.3 生物标志物的比较

本研究运用物种LEfSe进行差异判别分析，母乳喂养组较配方奶喂养组，样本中变形菌群（proteobacteria）的数量更高，厚壁菌群（Firmicutes）的数量却更低，见图5。

2.3.4 肠道微生态的演替

比较两组早产儿生后3、7、14、28 d的肠道菌群变化，结果显示，母乳喂养组生后3、7、14、28 d的肠道菌群种类分别是1 334、986、752、718种，生后28 d较生后3天减少了616种，新获得107种，消失720种（见图6A）；配方奶喂养组生后3、7、14、28 d的肠道菌群种类分别是916、603、395、181种，生后28 d较生后3 d减少了735种，新获得27种，消失762种，见图6B。

3 讨论

3.1 母乳对于BPD的保护作用

早产儿由于肺发育不成熟，肺泡表面活性物质缺乏，生后往往需要通过机械通气和高氧等来维持血氧饱和度。而机械通气容易诱导肺损伤，高浓度氧气吸入使机体产生较多氧自由基，高氧环境下出现氧化-抗氧化失衡，引起氧化应激，导致持续肺损伤，继而发生BPD^[10]。BPD患儿存在喂养困难、需长期氧疗、生长发育迟缓、住院时间长等问题，远期预后、生活质量均不理想。防治BPD的发生，对于提高早产儿生存和生命质量、减轻家庭经济和社会负担，显得尤为重要。多项研究说明，母乳喂养能降低BPD发生率，并且存在量效关系^[11-12]。SPIEGLER等^[13]的一项前瞻性多中心队列研究显示，纯母乳喂养组极低出生体重儿的BPD发生率（11.2%），明显低于配方奶组（20.9%）。HUANG等^[14]的meta分析结果提示，纯母乳喂养组比不同比例的配方奶喂养组的早产儿BPD发生率更低。PATEL等^[15]的研究揭示了母乳防治BPD的量效关系，发现至校正胎龄36周的过程中，母乳喂养量每增加10%，BPD发生率降低9.5%。MILLER等^[16]的研究发现，与低剂量母乳喂养相比，高剂量母乳喂养能够降低BPD发生率。

本研究中，母乳喂养组较配方奶喂养组早产儿的BPD发生率低，与上述研究结果一致^[13-16]。由此可见，母乳喂养对早产儿BPD具有保护作用。母乳的抗氧化成分，如乳铁蛋白、瘦素、胡萝卜素、溶菌酶等，可以缓解氧化应激、减少BPD的发生；母乳中生长因子、分泌型IgA、白细胞介素10和可溶性CD14含量高，可通过降低感染率、促进免疫系统发育来减少BPD发生^[17]。母乳中可能存在保护和（或）支持肺发育的特定成分，例如长链多不饱和脂肪酸，它可以促进细胞膜功能的成熟，以及肺表面活性物质的产生，而且还有抗炎特性，利于修复肺损伤^[18]。在明确母乳对BPD的保护作用后，进一步探究其基于“肺与大肠相表里”理论的内在作用机制具有重要意义。

3.2 基于“肺与大肠相表里”理论从微生态角度母乳对BPD的作用机制

根据中医藏象理论，五脏均有所合之腑，其中肺脏和肠腑之间关系密切，肺和大肠，是通过经脉的络属，从而构形成表里关系，即“肺与大肠相表里”^[19]。从生理角度来看两者相互为用、相互制约，从病理角度看两者相互传变、相互影响^[5]。而且，肺和肠都有相同的胚层来源^[20]。正是由于其组织结构同源，致使肺、肠微生态菌群发生同步变化。目前部分研究从“肺与大肠相表里”角度发现呼吸系统的疾病与肠道的微生态情况有着密切关联^[6,21]。彭韶等^[22]研究发现，反复肺炎的患儿肠道菌群发生改变，大肠杆菌增加，双歧杆菌减少。罗勇等^[23]研究显示，慢性阻塞性肺疾病的急性发作率与肠道菌群的紊乱有着联系。方骞等^[24]研究结果表明，呼吸系统疾病患儿肠道微生物里的有益菌数量减少。孙小钧^[25]研究发现了“肺与大肠相表里”的生物学基础之一，即TGF-β1/Smads 信号通路，为从中医肺肠同治过敏性哮喘合并肠道菌群失调提供了思路。王宝家等^[26]研究发现，溃疡性结肠炎大鼠合并了肺部损伤，肠道与肺部部分菌群同步发生规律性改变，证实了“肺与大肠相表里”。

研究表明，母乳喂养可能协助早产儿建立肠道微生态，同时对肺部菌群产生影响，降低早产儿BPD的发生风险^[27]。母乳细菌丰富了肠道微生物群的多样性。母乳喂养增加了早产儿肠道微生物α多样性^[28]。本研究采用Chao指数来度量肠道菌群Alpha多样性，其中母乳喂养组chao指数高于配方奶喂养组，与前人的研究一致^[28]。研究表明，母乳喂养婴儿的肠道菌群中，厚壁菌减少，拟杆菌种增加，肠道炎症水平更低^[29]。母乳喂养的极低出生体重儿，双歧杆菌和拟杆菌更加丰富。本研究显示，母乳喂养组的肠杆菌、月形单胞菌、假单胞菌平均相对丰度高于配方奶喂养组。母乳喂养可通过肠肺轴调节微生态及其代谢来降低BPD的发生率。

本研究的局限性在于受到疫情管控的影响，院外母乳运送受限，部分早产儿母乳喂养量少，且在母乳量不足时添加了配方奶喂养，可能会对数据造成一定的影响；本研究仅对母乳喂养组与配方奶喂养组肠道微生物的差异性进行了比较，未对母乳喂养量效关系进行探究，也未对母乳喂养组发生与未发生BPD的早产儿肠道微生物差异性进行分析。未来仍需开展更多大样本的深入研究，为从肠道微生态角度研究早产儿支气管肺发育不良提供更多的实验数据和新的研究思路。

4 结论

母乳喂养对早产儿BPD具有保护作用，母乳喂养增加了早产儿肠道微生物多样性，通过调节肠道微生物群，进一步对肺部菌群产生影响，从而降低早产儿BPD的发生。

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基金资助

四川省科技计划项目(2021JDRC0161)