YTHDF3敲低前后三阴性乳腺癌细胞非标记定量蛋白质组学差异分析

A Label-Free Differential Quantitative Proteomics Analysis of Triple-Negative Breast Cancer Cells Before and After YTHDF3Knockdown

摘要

目的 分析三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）细胞敲低YTHDF3（YT521-B homology domain family 3）前后的蛋白质表达差异，探究YTHDF3调控TNBC细胞蛋白质功能的可能机制。 方法 利用分子克隆、靶点设计和病毒载体包装技术构建YTHDF3稳定敲低的MDA-MB-231细胞系并采用Western blot法进一步验证。裂解细胞蛋白，采用超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）和液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）方法获取因敲低YTHDF3而出现的差异表达蛋白。使用String数据库及Cytoscape 3.10.1软件，绘制并分析蛋白质互作网络（protein-protein interaction，PPI）并筛选核心靶点。通过David数据库对核心靶点进行京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路和基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析。采用RNA干扰技术分别敲低MDA-MB-231和HS-578T细胞中的YTHDF3或UUbiquitin（BBB）基因，Western blot法验证YTHDF3敲低的两种TNBC细胞中核心靶蛋白的表达，并采用Transwell法检测UBB敲低对TNBC细胞侵袭和迁移的影响。 结果 成功构建了YTHDF3稳定敲低的TNBC细胞模型，并在该细胞中定量到2 295个蛋白，筛选出261个差异表达蛋白（126种下调和135种上调）。GO分析结果显示，差异下调蛋白主要涉及翻译和蛋白质稳定性，而对细胞群体增殖的负调控蛋白则是上调表达。KEGG结果表明，差异下调蛋白主要富集于剪接体相关信号通路，而差异上调蛋白主要与凋亡通路相关。PPI分析表明有6个核心靶点（RPS27A、UBA52、UBC、UBB、RPL4和RPS2）下调。Western blot分析揭示YTHDF3敲低的MDA-MB-231和HS-578T细胞中YTHDF3和UBB蛋白表达均降低。Transwell结果指出UBB缺失抑制TNBC细胞侵袭和迁移水平。 结论 本文以全新视角的研究，揭示了YTHDF3通过调控下游核心靶点UBB在TNBC细胞侵袭转移中发挥着重要作用。

Abstract

Objective This study aimed to analyze the protein expression differences of triple negative breast cancer （TNBC） cells before and after YTHDF3 knockdown and explore the possible mechanisms by which YTHDF3 regulates protein function in TNBC cells. Methods The YTHDF3 stably knocked down MDA-MB-231 cell lines were constructed using molecular cloning， target design and viral vector packaging techniques and further validated by Western blot. We cleaved the proteins and obtained the differentially expressed proteins caused by knockdown of YTHDF3 using Ultra Performance Liquid Chromatography （UPLC） and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry （LC-MS/MS） methods. Then， protein-protein interaction （PPI） networks were mapped and analyzed using the String database and Cytoscape 3.10.1 software， and core targets were screened. The core targets were analyzed for Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway and Gene Ontology （GO） functional enrichment through the David database. RNA interference was applied to knock down YTHDF3 or UBB gene in MDA-MB-231 and HS-578T cells， respectively. The expression of core target proteins in the two TNBC cells with YTHDF3 knockdown was verified by Western blot. Finally， the impact of UBB （Ubiquitin B） knockdown on the invasion and migration of TNBC cells was detected by Transwell assay. Results We successfully constructed a TNBC cell model with stably YTHDF3 knockdown and quantified 2 295 proteins as well as screened 261 differentially expressed proteins （126 down-regulated and 135 up-regulated）. GO analysis showed that the differentially down-regulated proteins were mainly involved in translation and protein stabilization， while the differentially up-regulated proteins were mainly associated with negative regulation of cell population proliferation. KEGG results indicated that the differentially down-regulated proteins were mainly enriched in spliceosome-related signaling pathways， whereas differentially up-regulated proteins were mainly relevant to apoptosis-related pathways. The PPI analysis revealed that six core targets （RPS27A， UBA52， UBC， UBB， RPL4， and RPS2） were all downregulated. Western blot analysis uncovered decreased expression of both YTHDF3 and UBB proteins in YTHDF3 knockdown MDA-MB-231 and HS-578T cells. Transwell results indicated that deficient UBB inhibited the invasion and migration levels of TNBC cells. Conclusions YTHDF3 plays a crucial role in the invasion and metastasis of TNBC cells by regulating the downstream core target UBB.

Graphical abstract

关键词

YTHDF3 / 敲低 / 三阴性乳腺癌 / 蛋白质组学 / 差异分析

Key words

YTHDF3 / Knockdown / Triple negative breast cancer / Proteomics / Differential analysis

乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤，近年来其发病率和死亡率在全球不断上升^[1]。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）约占乳腺癌的15% ~ 20%，是一种高度侵袭性乳腺癌亚型，其特征在于缺失孕激素受体、雌激素受体和人表皮生长因子受体2的表达^[2]。由于缺乏有效治疗靶点，TNBC患者预后复发率、转移率及死亡率极高^[3-5]。因此，TNBC已成为最具挑战性的乳腺癌亚型之一。

YTHDF3（YT521-B homology domain family 3）属于YTH结构域蛋白家族，被鉴定为一种能够识别N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰的“阅读器”蛋白^[6]。该蛋白通过特异性识别并结合RNA中的m⁶A位点，调控特定基因的表达。例如，YTHDF3通过与YTHDF1结合，增强其对m⁶A修饰mRNA的识别，从而提高翻译效率^[7]。YTHDF3通过与YTHDF2结合，促进m⁶A修饰mRNA的降解^[8]。YTHDF3还可在细胞质中与YTHDF1和YTHDF2共同作用，加速m⁶A修饰mRNA的代谢^[9]。尽管现有研究发现，YTHDF3在多种肿瘤中高表达并与肿瘤的发生发展密切相关，包括肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌等^[10-15]。然而，目前对于YTHDF3在TNBC进展中可能的作用机制仍未明了。基于此，本研究通过分析YTHDF3敲低前后TNBC细胞的蛋白质组学差异，深入探讨了YTHDF3在TNBC恶性进展中可能的作用机制，可为TNBC治疗提供新的靶点和策略。

1 材料与方法

1.1 材料

人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞购于中国科学院上海细胞库。嘌呤霉素、三（2-羧乙基）膦盐酸盐【Tris（2-carboxyethyl）phosphine hydrochloride,TCEP】、碘乙酰胺（IAA，iodoacetamide)、脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate，SDC）、Tris盐酸（pH 7.6）、C18柱、甲酸、乙腈、PMSF和碳酸氢铵购于美国Sigma-Aldrich公司。Omni-Easy一步法12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒购于上海雅酶生物医药科技有限公司。PVDF膜和脱脂牛奶购于美国Bio-Rad公司。兔抗YTHDF3、UBC、RPS2和RPL4特异性一抗购于美国Proteintech公司。兔抗RPS27A特异性一抗购于杭州华安生物有限公司。兔抗UBA52和UBB特异性一抗购于江苏百远生物有限公司。胰蛋白酶、RIPA裂解液、蛋白酶/磷酸化蛋白酶抑制剂和HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）二抗购于上海碧云天生物技术公司。BCA蛋白定量试剂盒购于美国ThermoFisher公司。DMEM培养基和胎牛血清购于美国Gibco公司。Nonidet P 40（NP-40）、NaCl、SDS和丙酮购于上海生工生物工程股份有限公司。pLV-hU6-NC shRNA-hef1a-mNeongreen-P2A-Puro（shCtrl）和pLV-hU6-YTHDF3 shRNA01-03（human）- hef1a -mNeongreen-P2A-Puro（shYTHDF3#1、shYTHDF3#2、shYTHDF3#3）慢病毒载体由北京合生基因科技有限公司构建。YTHDF3和UBB小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 YTHDF3稳定敲低TNBC细胞系的构建

将MDA-MB-231细胞以5 × 10⁴个细胞/孔密度种于24孔板中。待贴壁后，用含0 ~ 15 μg/mL嘌呤霉素的新鲜培养基孵育细胞4 d后，确定杀死所有细胞的嘌呤霉素最低浓度^[16]。同时，分别用感染滴度（multiplicity of infection，MOI） = 0、10、20、50和100的shCtrl和shYTHDF3（#1、#2、#3）慢病毒感染细胞72 h，并在激光共聚焦显微镜下观察细胞生长状态，判断慢病毒感染细胞的效率。继续用含有能杀死所有细胞最低浓度嘌呤霉素的培养基孵育慢病毒感染的细胞4 d，以筛选出稳定表达shCtrl和shYTHDF3（#1、#2、#3）的MDA-MB-231细胞。病毒量：每孔病毒量（μL） = MOI × 感染时的细胞数 × 1 000/滴度（TU/mL）。

1.2.2 Western blot法验证YTHDF3稳定敲低的TNBC细胞系

将上述感染shCtrl和shYTHDF3（#1、#2、#3）慢病毒的MDA-MB-231细胞用含1%总蛋白酶抑制剂和1%磷酸化蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解，用BCA蛋白检测试剂盒定量总蛋白浓度。蛋白样品用12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，甲醇活化PVDF膜，恒压20 V半干法转模1.5 h，常温下5%脱脂牛奶封闭1 h，再用兔抗YTHDF3特异性多克隆一抗（1∶2000）于4 ℃孵育过夜和HRP标记的山羊抗兔IgG（H + L）二抗（1∶5000）于室温孵育2 h，使用Syngene G：BOX Imaging System（cambridge，UK）可视化并分析蛋白条带。

1.2.3 蛋白质提取和定量

收集YTHDF3敲低前后的MDA-MB-231细胞，用含1% Cocktail蛋白酶抑制剂和1% Cocktail磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液（v∶v∶v = 1∶1∶100）于冰上裂解细胞30 min，14 000 g，4 ℃离心15 min，转移上清至新的离心管中。按照BCA蛋白检测试剂盒说明书，依次在96孔板中加入10 μL蛋白样品或标准蛋白（BSA，7个浓度梯度），最后加入AB显色混合液（A∶B = 50∶1）于37 ℃培养箱中孵育30 min，并通过全波长酶标仪在562 nm处检测吸光度。根据标准曲线计算相应样品的蛋白浓度。

1.2.4 质谱样本的制备

取100 μg总蛋白样品经丙酮沉淀、蛋白重溶、还原、烷基化及酶解后，充分混匀，简单离心后于37 ℃震荡孵育过夜。将三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）加入上述混合样品中以沉淀SDC，1000 rpm离心10 min，转移上清至新EP管中。加入n × 100 μL 2% TFA充分混匀，提取共沉淀多肽。重复提取后合并上清组分，1 000 rpm离心10 ~ 20 min，将上清移至新EP管中得多肽样品。随后，将上述样品加至脱盐柱中，低速离心并收集流出液，用含有0.1%甲酸和2%乙腈的1 mL Buffer A洗柱两次，以除去残余盐分。再加入400 μL Buffer B（0.1%甲酸和70%乙腈）洗脱多肽，收集流出液，真空干燥，再加入Buffer A重溶多肽至1 μg/μL，超声5 min，用于后续LC-MS/MS检测。

1.2.5 LC-MS/MS

取2 μg多肽采用Nano-UPLC液相系统进行分离，并使用Q-Exactive质谱仪进行检测。分析采用100 μm ID × 15 cm反向色谱柱（ReproSil-Pur 120 C18-AQ-Dr. Maisch，1.9 μm）。流动相A液为甲酸和2%乙腈水溶液；B液为0.1%甲酸和80%乙腈水溶液。以300 nL/min的流速洗脱多肽，肽离子化在320 ℃和2.0 kV条件下进行。数据采集采用350 ~ 1600 m/z全扫描模式，每个样品运行120 min。MS/MS扫描条件设定如下：MS AGC为2 × 10⁶，最大离子注入时间为50 ms，标准化碰撞能量为28%，隔离窗口为2 m/z，动态排除时间为40 s。

1.2.6 差异表达分析

为了确保数据分析的透明性和可复现性，本研究详细描述了采用Proteome Discoverer（Thermo Scientific，USA）和Progenesis QI for Proteomics（Waters and Nonlinear Dynamics，USA）软件进行蛋白质组学数据分析的具体流程和参数设置。

1.2.6.1 Proteome Discoverer数据处理

将原始LC-MS/MS.raw文件导入Proteome Discoverer软件，并对raw文件进行初步过滤，去除低质量谱图，以提高后续分析的准确性。使用SEQUEST算法对质谱数据进行蛋白质/肽段识别。检索Uniprot人类蛋白库（https://www.uniprot.org/peptide-search），确保所有已识别的肽段都能找到对应的蛋白质条目。设置前体离子的质量容限 ± 20 ppm，片段离子的质量容限 ± 0.6 Da，以确保较高的识别精度。动态修饰设定为蛋氨酸氧化（+ 15.995 Da），静态修饰设定为半胱氨酸氨甲基化（+57.021 Da）。允许最多两次漏切，消化酶设定为胰蛋白酶。使用Percolator模块对检索结果进行后处理，将错误发现率（false discovery rate，FDR）控制在5%以下，以确保数据的可靠性。结合q-value、肽段长度、修饰一致性、漏切数等参数，进一步筛选出高置信度的蛋白质和肽段，剔除可能的假阳性结果。针对各个样本，计算肽段和蛋白质的相对丰度，并进行归一化处理，以消除实验条件差异带来的影响。

1.2.6.2 Progenesis QI for Proteomics差异表达分析

将Proteome Discoverer处理后的mzML格式文件导入Progenesis QI for Proteomics软件，并对样本进行对齐和归一化处理，确保样本间的可比性。使用Progenesis QI for Proteomics内置的ANOVA模块，对YTHDF3敲低前后的MDA-MB-231细胞蛋白质组进行差异表达分析。本实验多肽和蛋白水平FDR均控制在0.01，将表达倍数差异的蛋白（Fold change > 1.2，P < 0.05）定义为差异显著蛋白。通过火山图展示差异蛋白的变化趋势。

1.2.7 KEGG和GO分析

将差异显著靶点输入到David数据库（https://davidbioinformatics.nih. gov/）。选择“OFFICAL GENE SYMBOL → Homo sapiens → Gene List”，在新弹出网页中接着选择“Functional Annotation Clustering”及“Gene_Ontology”或“Pathways”，点击“Functional Annotation Chart”下载相关文件。运用R包进行GO/KEGG富集分析。GO注释主要分析生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组成（cellular component，CC）。

1.2.8 蛋白质互作网络分析

将获得的差异显著蛋白上传至STRING数据库（https://cn.string-db.org/）进行蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络分析，选择“Multiple proteins”和“Homo sapiens”，导出“string_interactions_short.tsv”文件，通过Cytoscape 3.10.1软件对PPI网络图进行可视化处理，并利用Cytoscape软件中的Centiscape 2.2插件筛选核心靶点^[17]。

1.2.9 RNA干扰及Western blot验证

MDA-MB-231和HS-578T细胞经无血清和抗生素的Opti-MEM培养基洗涤3次，然后用Lipofectamine 2000转染4 μg siYTHDF3/siUBB和siCtrl（阴性对照）24 h。siRNA序列如下：siCtrl:sense：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，antisense：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'；siYTHDF3：sense：5'-CAGGCUUCAACCAGAACAA-3'，antisense：5'-UUGUUCUGGUUGAAGCCUG-3'；siUBB:sense：5'-AAGAUGAAGCCUCUGCUGGUU-3'，antisense：5'-AAAGAUGAAGCCUCUGCUGG-3'。将上述两种TNBC细胞经蛋白裂解、定量、电泳、甲醇活化PVDF膜、恒压半干法转膜和脱脂牛奶封闭后，再用RPS27A、UBA52、UBC、UBB、RPL4、RPS2和YTHDF3一抗于4 ℃孵育过夜及HRP标记的IgG（H + L）二抗于室温孵育2 h，使用Syngene G:BOX Imaging System（Cambridge，UK）可视化并分析蛋白条带。

1.2.10 Transwell法检测细胞侵袭和迁移

将转染siCtrl和siUBB的MDA-MB-231和HS-578T细胞分别种于含有基质胶的Transwell嵌套的上室，于37 ℃培养48 h。取下小室，固定、结晶紫染色，光镜下进行侵袭细胞计数并拍照。细胞迁移实验方法同上。

1.3 统计学分析

所有细胞实验的数据均采用SPSS 20.0软件进行统计学分析并以均数 ± 标准差（\overline{x} ± s）表示。采用单因素方差分析和Tukey HSD检验进行多组间比较。采用配对样本t检验比较两组间差异。P < 0.05表示差异有统计学意义。对蛋白质组学差异表达分析进行多重假设检验，以避免高假阳性率。将蛋白FDR阈值设定为0.01，并采用Benjamini-Hochberg法进行筛选。多组间两两比较采用Bonferroni校正调整P值。

2 结果

2.1 YTHDF3稳定敲低MDA-MB-231细胞系的构建与验证

如图1A和1B所示，相比于MOI = 0的shCtrl和shYTHDF3（#1、#2、#3）慢病毒感染的MDA-MB-231细胞，MOI = 10 ~ 100的上述慢病毒作用72 h后明显增强MDA-MB-231细胞中的绿色荧光强度，于是选择MOI = 20 ~ 50慢病毒感染细胞，以构建YTHDF3稳定敲低的MDA-MB-231细胞系，shCtrl细胞作为阴性对照。Western blot结果表明，相比于shCtrl组，shYTHDF3#3慢病毒感染的MDA-MB-231细胞中YTHDF3蛋白水平下降最为显著，被用于蛋白质组学分析中。见图1C。

2.2 shCtrl和shYTHDF3慢病毒感染的MDA-MB-231细胞中蛋白质差异表达分析

为评估YTHDF3敲低前后MDA-MB-231细胞中蛋白质表达差异，按照P < 0.05和Fold change > 1.2的条件进行蛋白质组学测序，共富集到2 295个蛋白质，筛选出261个差异显著蛋白，其中下调蛋白126个及上调蛋白135个，见图2，表1。

2.3 shCtrl和shYTHDF3慢病毒感染的MDA-MB-231细胞中差异表达蛋白的GO分析

将上述差异蛋白对应基因导入David数据库进行GO功能富集分析，发现敲低YTHDF3获得的差异表达蛋白主要与细胞增殖分化、基因表达和翻译、蛋白质代谢、细胞内运输、细胞骨架结构及分子相互作用等方面相关，见图3。重要的是，YTHDF3敲低细胞的差异表达蛋白在生物过程中的富集主要涉及细胞群体增殖的负调控、翻译、蛋白质稳定性、mRNA加工、修饰依赖性蛋白质分解代谢过程等，其中差异下调蛋白主要涉及翻译和蛋白质稳定性，而对细胞群体增殖的负调控蛋白则是上调表达。

2.4 shCtrl和shYTHDF3慢病毒感染的MDA-MB-231细胞中差异表达蛋白的KEGG分析

将上述差异蛋白对应基因导入David数据库进行KEGG通路富集分析，发现敲低YTHDF3获得的差异表达蛋白主要在剪接体、自噬、泛素介导的蛋白水解、凋亡等相关通路中显著富集，其中差异下调蛋白主要富集于剪接体相关信号通路，而上调蛋白主要富集于凋亡通路等，见图4。

2.5 shCtrl和shYTHDF3慢病毒感染的MDA-MB-231细胞中差异表达蛋白PPI网络构建

将上述差异表达蛋白对应基因导入String数据库，进行PPI网络互作分析，见图5。结果发现，敲低YTHDF3基因后，核心靶点为核糖体蛋白S27a（ribosomal protein S27a,RPS27A）、泛素A52残留核糖体蛋白融合产物1（ubiquitin A52 residue ribosomal protein fusion product 1，UBA52）、泛素C（ubiquitin C,UBC）、泛素B（ubiquitin B,UBB）、核糖体蛋白L4（Ribosomal protein L4，RPL4）和核糖体蛋白S2（Ribosomal protein S2，RPS2）均显著下调，见表2，提示YTHDF3可能通过调控这些关键靶点影响TNBC细胞进展。

2.6 验证YTHDF3敲低的两种TNBC细胞中核心靶蛋白的表达

Western blot结果显示，相比于阴性对照组，YTHDF3敲低的MDA-MB-231和HS-578T细胞中YTHDF3和UBB蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05），见图6A - 6C。但RPL4、RPS27A、UBA52、RPS2和UBC蛋白表达水平在YTHDF3敲低的两种TNBC细胞中并没有明显改变，见图6A、6D-6H。

2.7 敲低UBB抑制两种TNBC细胞侵袭和迁移

Western blot显示，相比于阴性对照组，UBB敲低的MDA-MB-231和HS-578T细胞中UBB蛋白表达水平显著降低，见图7A、7B，差异有统计学意义（P < 0.05）。Transwell结果显示，相比于阴性对照组，敲低UBB显著抑制了MDA-MB-231和HS-578T细胞的侵袭和迁移能力，见图7C-7E，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

肿瘤细胞在发生发展过程中会促进表观遗传改变，如RNA修饰的改变^[18]。m⁶A作为真核细胞内最丰富的RNA修饰参与调节多种生物过程并与TNBC恶性进展相关^[18]。m⁶A活性由三个关键的元件调控，如去甲基化酶、甲基化转移酶和甲基化阅读蛋白，它们决定着RNA代谢的所有关键因素，包括RNA稳定性/衰变、翻译和选择性剪切等^[19]。YTHDF3作为一种m⁶A甲基化阅读蛋白，参与调控翻译和RNA降解^[7-8]。近来，YTHDF3在乳腺肿瘤中的作用日益被重视。既往研究表明，YTHDF3能够通过增强ST6GALNAC5、GJA1和EGFR m⁶A富集转录本的翻译促进乳腺癌脑转移^[18]。此外，YTHDF3在TNBC患者中的高表达与其不良预后正相关，并以m⁶A依赖的方式稳定ZEB1 mRNA促进TNBC细胞转移^[15]，提示YTHDF3在TNBC中具有促癌作用。与既往研究不同，本研究全面揭示了YTHDF3对TNBC细胞整体蛋白质组的影响，旨在以全新的视角深入探明YTHDF3在TNBC恶性进展中的分子机制。

通过对MDA-MB-231细胞敲低YTHDF3基因获得的差异表达蛋白进行GO分析，本研究发现涉及翻译和蛋白质稳定性的差异蛋白下调表达。在TNBC中，一些基因的异常表达可能与翻译过程的失调相关。这可能导致肿瘤细胞中特定蛋白质的过度产生或不足，从而影响TNBC的发生发展^[20-22]。研究发现，m⁶A阅读器IGF2BP2在TNBC中高表达，并通过募集EIF4A1促进CDK6的翻译输出，进而促进TNBC细胞增殖^[20]。在TNBC小鼠模型中，选择性抑制Sox4翻译可重组肿瘤翻译格局，从而有助于佐他替芬诱导的IFN应答，并最终抑制TNBC恶性进展^[21]。另有研究指出，通过抑制BCKDK阻断蛋白质翻译，损害了线粒体功能并增强化疗药对TNBC的细胞毒作用^[22]。研究发现，辐射抗性TNBC细胞中ATF4的激活，引发与谷胱甘肽生物合成相关基因（GCLC、CTH和SLC7A11）的转录，从而增加细胞内还原性谷胱甘肽水平和辐射后ROS的清除；谷胱甘肽生物合成的破坏增加了辐射抗性TNBC细胞中ROS积累，促使细胞对放疗敏感^[23]。由此可知，抑制翻译在TNBC中可作为一种有前途的治疗策略^[24]。

蛋白质稳定性与TNBC的关系密切。在TNBC中，蛋白质稳定性的改变可能导致蛋白质的功能丧失或异常^[25-27]。蛋白质稳定性增加可促进细胞周期的进展，加速TNBC细胞增殖、耐药和转移^{[26, 28-30]}。如，PARP1的稳定性增加能够促进TNBC细胞的增殖和存活^[28]。维持STMN1蛋白稳定性导致TNBC细胞对紫杉醇耐药^[29]。去泛素酶或去泛素化修饰影响蛋白质稳定性。在TNBC中，一些去泛素酶的异常表达导致特定蛋白质的稳定性改变，进而影响细胞增殖、侵袭和迁移水平。研究发现，TCF4的去泛素化修饰有助于其蛋白质稳定性，进而促进TNBC的发生和进展^[26]。通过去泛素酶USP9X去泛素化PPP1R14B，增加PPP1R14B稳定性，导致其在TNBC组织中过表达，促进TNBC细胞增殖和转移^[29]。去泛素酶USP1与TAZ相互作用增加了TAZ蛋白的稳定性；相反，USP1功能丧失通过增加多泛素化降低TAZ蛋白水平，导致TNBC细胞增殖和迁移的降低^[30]。另外，TNBC细胞中某些关键信号通路中的蛋白质稳定性改变导致信号转导异常^[31]。例如，在正常条件下，Wnt/β-catenin通路中的信号转导受到严格的调控。Wnt信号的激活促使β-catenin在细胞质中稳定存在，并进入细胞核与转录因子结合，进而启动下游靶基因的转录^[32]。但β-catenin的稳定性会增加并导致其在细胞核内过度累积，这种异常的积累导致下游癌基因的过度表达，进而促进TNBC细胞进展^[33]，提示该通路中蛋白质稳定性改变与信号转导异常之间的关系。这些研究表明，降低蛋白质稳定性可能对TNBC细胞的恶性进展具有重要意义。

通过对MDA-MB-231细胞敲低YTHDF3基因获得的差异蛋白进行KEGG分析，本研究发现剪接体相关信号通路蛋白下调表达。剪接体是负责mRNA前体剪接的主要分子机器，通过调控mRNA剪接模式，影响翻译产物的结构与功能及蛋白质稳定性。然而，剪接体信号通路的异常可能导致选择性剪接的变化，从而产生具有异常功能或活性的蛋白质。这些异常蛋白与TNBC的发生发展和转移密切相关^[34-36]。例如，U2SURP可通过去除内含子3促进SAT1前mRNA的选择性剪接，进而增加SAT1 mRNA的稳定性及其蛋白水平，推动TNBC的发展^[37]。CPEB2的选择性剪接有助于TNBC的失巢凋亡抵抗和转移^[35]。在TNBC细胞中，可观察到DCUN1D5外显子4跳跃减少和DCUN1D5高表达^[36]。值得注意的是，DCUN1D5的高表达与TNBC患者较差的5年总生存率和无复发生存率相关^[36]。此外，剪接体信号通路的异常还会影响免疫系统对TNBC的识别和攻击，导致TNBC细胞逃避免疫监视，促进TNBC细胞的生长和转移^[38]。由此可知，抑制剪接体相关信号通路可能有助于TNBC治疗。因此，深入研究剪接体相关通路在TNBC进展中的调控机制，可能为TNBC的诊断和治疗提供新的靶点。

PPI网络分析表明敲低YTHDF3基因后所得的核心靶点RPS27A、UBB、UBA52、RPL4、RPS2等均明显下调。研究发现，RPS27A作为泛素C端延伸蛋白，其通过调节核糖体生物发生、蛋白质翻译后修饰和稳定性^[39]，参与肿瘤发生^[40]。还有研究表明，RPS27A在TNBC中高表达^[29]，并通过募集去泛素酶USP9X稳定PPP1R14B蛋白，激活下游促癌信号，显著增强TNBC细胞的增殖、集落形成、侵袭迁移和对化疗药的抗性^[29]，说明RPS27A增强蛋白质稳定性并促进TNBC进展，而下调RPS27A表达对TNBC治疗可能具有积极作用。作为泛素前体蛋白，UBB参与泛素化反应，影响蛋白质稳定性，进而影响肿瘤细胞的恶性表型^[41-43]。在TNBC中，沉默UBB几乎完全抑制细胞活性^[44]，这说明下调UBB表达对TNBC治疗也具有积极作用。尽管目前针对UBA52、RPL4及RPS2在TNBC中的直接研究有限，但这些靶点在泛癌中的已知功能提示其在TNBC中可能具有重要的调控作用。UBA52基因编码核糖体蛋白与泛素融合分子，在肿瘤中高表达并通过EMC6依赖的自噬途径促进肿瘤细胞恶性表型；而下调UBA52表达可诱导自噬，进而抑制肿瘤进展^[45]。鉴于自噬在TNBC中呈现双重作用，既可抑制肿瘤的早期形成，也可促进肿瘤的晚期发展和化疗耐药^[46-50]，推测UBA52可能通过动态调控自噬潮影响TNBC进展，但其具体作用需结合TNBC分子亚型进一步验证。作为核糖体大亚基蛋白，RPL4在TNBC组织中表达上调并与患者预后不良显著相关^[51]，这为下调RPL4治疗TNBC的研究提供一定的指导。其潜在机制可能涉及核糖体应激介导的致癌信号（如c-Myc激活）或翻译重编程^[52-54]，但RPL4是否维持TNBC进展仍需实验验证。RPS2作为核糖体小亚基关键组分，通过调控rRNA加工和蛋白质翻译影响细胞增殖^[55]。研究表明，下调RPS2表达可诱导肿瘤细胞凋亡并抑制生长^[56]，提示其可能参与TNBC调控。然而，RPS2与TNBC的直接关联仍需体内外实验进一步验证。针对核心靶蛋白的细胞实验显示，敲低YTHDF3可抑制HS-578T和MDA-MB-231细胞YTHDF3和UBB蛋白表达，却没有导致其RPL4、RPS27A、UBA52、RPS2和UBC蛋白表达的显著改变。分析其原因可能是由于质谱法与Western blot的灵敏度和特异性不同所致。其次，PPI网络分析基于蛋白质组学的数据，而蛋白质组学结果本身可能存在假阳性或假阴性。UBB对TNBC细胞侵袭和迁移作用结果显示，敲低UBB抑制了HS-578T和MDA-MB-231细胞侵袭和迁移能力。基于此，本研究揭示UBB是YTHDF3在TNBC细胞侵袭迁移中发挥重要作用的下游关键靶点，为进一步研究YTHDF3在TNBC中的作用及机制提供了新的线索。鉴于UBB通过泛素化修饰网络调控肿瘤细胞翻译效率和蛋白质稳态，推测其功能异常与肿瘤发生发展密切相关。未来将进一步揭示YTHDF3调控的UBB在TNBC转移中的具体作用机制。

4 小结

本研究首次对YTHDF3敲低前后的TNBC细胞进行全面的蛋白质组学分析，初步揭示了YTHDF3通过调控核心靶点UBB影响TNBC细胞侵袭迁移，为TNBC治疗提供新的靶点，但对于核心靶点的功能及其深入的分子机制今后仍需要进一步的实验验证。

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基金资助

四川省科技厅项目(2023NSFSC0741)

泸州市-西南医科大学科技战略合作项目(2024LZXNYDJ092)

国家级大学生创新创业训练项目(202310632104)

校级大学生创新创业项目(2024317)