EGFR野生型非小细胞肺癌中CD44对PD-L1的调控作用研究

Research on the Regulatory Fffect of CD44 on PD-L1 in EGFR Wild-Type Non-Small Cell Lung Cancer

摘要

目的 研究PD-L1在表皮生长因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）野生型非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中CD44调控作用下的不同表达，并揭示过程中可能的分子机制，为EGFR野生型NSCLC靶向和免疫治疗提供新的靶点。 方法 ① 采用生物信息学方法，结合TCGA数据库系统进行数据检索和分析，探索EGFR野生型NSCLC中CD44与PD-L1的表达相关性，以及两者共高表达与肺癌患者的生存率分析。② 体外培养人EGFR野生型NSCLC细胞系（H1299、H460、A549），利用流式细胞术、qPCR、western blot检测CD44经敲低或过表达处理后对EGFR野生型NSCLC表面标志物PD-L1的阳性细胞群体比例、mRNA及蛋白表达水平的影响。③ 采用GraphPad Prism软件（v9）进行统计分析和创建图形，定量数据以均值 ± 标准差表示，组间差异采用非配对t检验进行统计学分析。 结果 生信分析结果表明，EGFR野生型NSCLC中CD44表达与PD-L1表达水平呈显著正相关（肺腺癌：P < 0.05，R = 0.54；肺鳞癌：P < 0.05，R = 0.19），且两者高表达与肺癌病人低生存显著相关（HR = 0.65，95% CI：1.57 ~ 2.57，P = 0.023）。在H1299、H460及A549细胞中，CD44敲低处理之后细胞表面标志物PD-L1的阳性细胞群体比例、mRNA及蛋白表达水平显著降低（P < 0.05）。基因CD44经过表达处理之后，H1299、H460细胞表面标志物PD-L1的mRNA及蛋白表达水平上升（P < 0.05）。 结论 EGFR野生型NSCLC细胞中CD44对PD-L1具有明显的正向调控作用，且两者共高表达与肺癌的预后不良相关。

Abstract

Objective This project primarily investigated the regulation of CD44 on PD-L1 in EGFR wild-type Non-small cell lung cancer （NSCLC）， and revealed the potential molecular mechanism of the process， aiming to identify a novel target for targeted therapy and cancer immunotherapy of EGFR wild-type NSCLC. Methods 1. Bioinformatics analysis was employed in conjunction with TCGA database for data retrieval and analysis to investigate the association between CD44 and PD-L1 expression in EGFR wild-type NSCLC， as well as the survival rate analysis of patients with high co-expression of both. 2. Human EGFR wild-type NSCLC cell lines （H1299， H460， A549） were cultured in vitro. Flow cytometry， qPCR and western-blot were utilized to assess the impact of CD44 knockdown or overexpression on the positive cell population ratio， mRNA and protein expression levels of PD-L1 in EGFR wild-type NSCLC cells. 3. GraphPad Prism software （v9） was used for statistical analysis and graph creation. Quantitative data are presented as mean ± standard deviation （Mean ± SD）， and intergroup differences were analyzed by unpaired t-test. Results Bioinformatics analysis showed a significant positive correlation between CD44 expression and PD-L1 expression levels in EGFR wild-type NSCLC （Lung Adenocarcinoma： P < 0.05， R = 0.54； Lung squamous cell carcinoma： P < 0.05， R = 0.19）. Moreover， the high expression level of CD44 and PD-L1 is associated with decreased overall survival of NSCLC patients when compared with CD44 and PD-L1 negative patients （HR = 0.65， 95% CI： 1.57 ~ 2.57， P = 0.023）. In H1299， H460 and A549 cells， the proportion of positive cell populations， mRNA and protein expression levels of PD-L1 were significantly decreased after CD44 knockdown （P < 0.05）. After CD44 overexpression， the mRNA and protein expression levels of PD-L1 in H1299 and H460 cells were increased （P < 0.05）. Conclusion CD44 in EGFR wild-type NSCLC cells has a positive regulatory effect on PD-L1， and the co-high expression of both is associated with a poor prognosis of lung cancer.

Graphical abstract

关键词

野生型非小细胞肺癌 / PD-L1 / CD44 / EGFR

Key words

non-small cell lung cancer / PD-L1 / CD44 / EGFR

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，全球每年有1万人死亡^[1]，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌最常见的病理类型，占全部肺癌的85%^[2-3]，是一种程度高、进展快的疾病^[4]，初期缺乏典型的临床相关症状，发现往往已处在中晚期，治疗手段和疗效受限。早期患者的整体5年总生存率可达45%以上，而中晚期患者5年总生存率常低于10%^[5]。

表皮生长因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）^[6]作为跨膜酪氨酸激酶受体，能将重要的生长因子信号从细胞外环境传递到细胞内部。其激酶结构域的突变是部分NSCLC的重要驱动因素及治疗靶点^[7-9]，但针对占相当比例的EGFR野生型患者，特别是免疫治疗疗效预测标志物的探索仍面临重大挑战。

近年研究发现，癌症干细胞标志物CD44与免疫检查点分子程序性死亡配体1（Programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）可能存在功能关联。CD44作为透明质酸（hyaluronic acid，HA）的主要受体，与HA相互作用，对于肿瘤的发展、转移和化学抗性的表达起着至关重要的作用^[10-11]。PD-L1，也被称为CD274^[12]，与PD-1受体在肿瘤组织中结合，会抑制抗原特异性CD8^＋T细胞的活化、扩增和效应功能，同时帮助癌细胞逃避免疫系统的破坏^[13-14]。既往研究提示，CD44是PD-L1表达的潜在正向调节因子^[15-16]，尤其是三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌中。然而，在EGFR野生型NSCLC这一特定亚群中，CD44对PD-L1的具体调控作用及其机制还有待进一步的深入研究。

本研究通过体外实验，系统性探究了EGFR野生型NSCLC细胞中CD44对PD-L1的调控作用及其潜在分子机制，旨在明确CD44-PD-L1调控轴在EGFR野生型NSCLC中的存在性和运作方式，为该亚型肿瘤的免疫逃逸机制提供新见解，并能够鉴定CD44作为潜在的预测PD-L1表达水平或免疫治疗反应的生物标志物，为EGFR野生型NSCLC的精准免疫治疗提供更精细的分层工具，研究具有重要的临床借鉴意义。同时阐明CD44调控PD-L1的关系，可为设计靶向CD44或其下游通路以增强PD-1/PD-L1抑制剂疗效的新型联合免疫治疗方案、改善EGFR野生型NSCLC患者的临床预后提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

siRNA由南京金斯瑞生物科技有限公司提供；RIPA裂解液购自碧云天生物有限公司；jet PRIME缓冲液试剂购自法国Polypus transfection；总RNA抽提试剂Trizol购自北京普利莱基因技术有限公司；ChamQ Universal SYBR qPCR、5 × HiScript Ⅲ qRT Super Mix、4 × gDNA wiper Mix和5 × No RT Control Mix由诺唯赞生物科技股份有限公司提供。

1.2 细胞系及细胞培养

细胞系H1299、H460及A549由本实验室自行保存和维护。培养前需将于-80 ℃冰箱中冻存的细胞系（H1299、H460及A549）按“快复慢冻”的原则复苏，然后，将细胞转移至含有10%胎牛血清的DMEM培养基中（A549细胞用10% 1640培养基培养），置于37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱中进行培养，静置24 h，隔天换液。

1.3 CD44的敲低与过表达

当细胞到达对数生长期时，取适量接种到6孔板中，分别进行对基因CD44的敲低处理和过表达处理。CD44基因的敲低即进行siRNA干扰实验，参考课题组已发表的研究^[17]，在细胞（H1299、H460、A549）融合度达50%时，首先在200 µL的jet PRIME缓冲液中稀释306 ng的siRNA，涡流10 s，然后添加4 µL jet PRIME试剂（摇匀即可，不可涡旋），在37 ℃条件下孵育10 min，最后将转染混合物加入相应的6孔板中，培养24 ~ 72 h，第2 ~ 3天可以测量基因的表达。对基因CD44的过表达处理即进行转染质粒实验，在细胞（H1299、H460）融合率60% ~ 80%时转染细胞，首先在200 µL的jet PRIME缓冲液中稀释2 µg的DNA，涡流10 s，然后添加4 µL jet PRIME试剂，在37 °C条件下孵育10 min。同样将转染混合物加入相应6孔板，培养24 ~ 72 h，第2 ~ 3天可以测量基因的表达。

1.4 相关性分析

通过美国国立癌症研究所基因组数据共享平台（Genomic Data Commons，GDC；https://portal.gdc.cancer.gov/）获取TCGA-LUAD（肺腺癌）和TCGA-LUSC（肺鳞癌）数据。经筛选后，最终纳入EGFR野生型非小细胞肺癌样本995例用于相关性分析，其中肺腺癌502例，肺鳞癌493例。通过R语言的TCGA biolinks包完成数据整合，CD44与CD274（即PD-L1）的相关性分析采用Spearman秩相关系数，分析前通过Shapiro-Wilk检验确认数据非正态分布特性（P < 0.001），所有可视化图表均采用ggplot2生成。

1.5 生存分析

从SangerBox网站获取了TCGA肺腺癌(LUAD)数据，并筛选出原发性和复发性肿瘤样本（n = 502）用于生存分析。在R语言中，本研究使用survminer包的surv_cutpoint函数计算CD274和CD44的最佳分界点，并据此将患者分为4组（CD274⁺CD44⁺、CD274^-CD44^-、CD274⁺CD44^-、CD274^-CD44⁺ ）。随后，我们保留研究重点组别CD274⁺CD44⁺ 和CD274^-CD44^- （n = 354），并采用Kaplan-Meier方法评估10年总生存率。

1.6 实时荧光定量PCR

使用600 µL总RNA抽提试剂Trizol从上述经敲低处理及对照处理、过表达处理及对照处理的细胞中分离出总RNA，并用4 µL的4 × gDNA wiper Mix去除残留的基因组DNA，随后使用4 µL的5 × HiScript Ⅲ qRT Super Mix进行复合逆转录实验合成cDNA。在实时英光定量PCR （qPCR） 管中配制混合液加入2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 µL、Primer 1 （10 µM） 0.4 µL、Primer 2 （10 µM） 0.4 µL、加入上述合成的cDNA模板0.2 µL，最后加入ddH₂O加至20.0 µL。调整好反应程序，将配制好的混合液离心后，将其放置于PCR仪器上进行扩增反应。实验以GAPDH作为内参，通过2^-ΔΔCt法计算CD44及PD-L1的相对表达量，每个样本设置3个复孔，引物信息如表1所示。

1.7 流式细胞术

取上述经敲低处理及对照处理的EGFR野生型NSCLC细胞系（H1299、H460、A549）细胞用磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline，PBS）重悬，用预冷处理的PBS染色缓冲液洗涤，离心（4 ℃，200 rpm，5 min），重复两次，紧接着用预冷处理的PBS染色缓冲液调节细胞数目至2 × 10⁷个细胞/mL；然后将100 µL细胞悬液转移至12 × 75 mm圆底微孔板，加入适量的特异性表面抗体（Anti-CD44 antibody［MEM-85］，abcam，货号：ab2212；PD-L1（E1L3N）XP Rabbit mAb，Cell Signaling，货号：13684s），并在冰上避光孵育20 min；用适量的Stain Buffer（200 µL/孔/次）洗涤细胞两次，离心（300 rpm，5 min），弃上清；按说明书向100 µL Stain Buffer中加入适量二抗或链霉素标记抗体进行染色（CD44：488荧光；PD-L1：568荧光），最后用适量的PBS重悬细胞（200 µL/孔），通过流式细胞术进行分析。

1.8 Western blot

取上述经敲低处理及对照处理、过表达处理及对照处理的细胞中的EGFR野生型NSCLC细胞系（H1299、H460、A549）细胞沉淀，加入适量裂解液，分别提取总蛋白，用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。将所有蛋白质样品调整至均匀浓度，并煮沸5 min使蛋白充分变性。然后，进行SDS-PAGE电泳，向电泳槽中加入足够的电泳溶液，然后加载样品（35 kD）及marker（4 µL）进行电泳，先将电压调至80 V进行电泳，待蛋白样品电泳至下层分离胶时，暂停电泳，随后将电压调整至90 V继续电泳，根据Marker指示，蓝色条带跑至胶的边缘停止电泳。然后，将蛋白质转印到PVDF膜上，在90 V的恒压下转膜120 min，用5%脱脂牛奶封闭，然后在4 ℃下用CD44及PD-L1一抗（1∶1000）孵育过夜，第2日进行二抗（1∶3000）孵育、化学发光和自动成像完成反应。使用Image J软件定量分析蛋白质条带的灰度值。

1.9 统计学分析

GraphPad Prism软件（v9）用于进行统计分析和创建图形，定量数据以均值 ± 标准差（\overline{x} ± s）表示，组间差异采用非配对t检验进行统计分析，P < 0.05表示差异有统计学意义。所有实验均独立重复3次。

2 结果

2.1 肺癌组织中CD44与PD-L1呈正相关

对TCGA数据库下载的数据进行分析，研究EGFR野生型非小细胞肺癌CD44与CD274（PD-L1）的表达相关性，见图1A和1B。图1A中得到的结果显示P < 0.05，说明EGFR野生型非小细胞肺癌中肺腺癌的CD44基因与PD-L1基因之间存在相关关系。由图1A可知，CD274基因呈现随CD44基因增加而增加的趋势，且相关系数R = 0.54，表明CD44基因与CD274基因呈正相关关系。同理，图1B所示，其中P < 0.05，且相关系数R = 0.19，说明在EGFR野生型非小细胞肺癌中肺鳞癌的基因CD44与PD-L1基因呈正相关系。

生信分析结果显示，EGFR野生型非小细胞肺癌中基因CD44与PD-L1基因呈现正相关关系，这有利于对EGFR野生型NSCLC中CD44对PD-L1的调控作用的研究，并且有利于后续实验的正常进行。

2.2 敲低CD44后显著降低EGFR野生型NSCLC细胞中的PD-L1的阳性细胞群体比例

图2为采用流式细胞术检测经敲低处理CD44对EGFR野生型NSCLC细胞系细胞表面标志物PD-L1表达的影响。将敲低处理CD44的实验组记为siCD44组，未经敲低处理的对照组记为siNC组。图2A、2C和2E分别为EGFR野生型NSCLC细胞系H460、H1299、A549经siNC或siCD44处理后得到的流式结果图，siNC组与siCD44组都检测了膜表面CD44和PD-L1阳性的表达。图2B、2D和2F直观反映CD44和PD-L1的阳性细胞群体数量变化情况。

如图2A和2B所示，在H460细胞中，CD44敲低后，CD44阳性细胞的百分比含量从siNC组的近100%显著降低至60%，即经敲低处理后siCD44组CD44明显低于（P < 0.001）siNC组，同步观测到siCD44组PD-L1阳性细胞比例相较于siNC组亦显著降低约25%（P < 0.001）。在H1299细胞（图2C、2D）中，CD44敲低导致CD44阳性率从75%降至60%（P < 0.001），同时PD-L1阳性百分数从5%降低至2%（P < 0.01）。在A549细胞系中（图2E、2F），CD44敲低处理使CD44阳性细胞比例由95%急剧下降至40%（P < 0.0001），且PD-L1表达水平亦由12%显著降至4%（P < 0.0001）。

结果表明，CD44敲低可有效降低EGFR野生型NSCLC细胞的PD-L1表达，且调控效应在A549细胞中最为突出，提示CD44对PD-L1具有正向调控作用。

2.3 敲低CD44后显著降低EGFR野生型NSCLC细胞系中PD-L1的mRNA及蛋白水平

如图3 A和B为应用qPCR检测siCD44对EGFR野生型非小细胞肺癌细胞H460、H1299及A549中CD44和PD-L1 mRNA表达水平的影响。如图3A所示，在H460、H1299及A549细胞中，siCD44组CD44基因mRNA相对表达水平明显低于对照组（siNC组）（P < 0.01）。图3B实验结果显示，与siNC组相比，CD44敲低同时引起PD-L1表达下调。H1299细胞的PD-L1下调最为明显（P < 0.01）；H460细胞次之（P < 0.05）；而在A549细胞变化最小，未达统计学差异，但仍观察到PD-L1表达呈下降趋势，与预期的实验结果相符合。

进一步通过Western blot及灰度分析检测siCD44对肺癌细胞系H460、H1299及A549中PD-L1蛋白表达水平的影响。图3C结果显示，siCD44处理显著降低H460和A549细胞中CD44及PD-L1蛋白表达，但在H1299细胞中，siCD44组CD44的表达量略有降低，PD-L1的表达量降低不明显。但图3D的灰度定量分析显示，CD44敲低处理组中PD-L1蛋白表达水平较siNC对照组呈现显著下调：H460、H1299及A549细胞的相对表达量分别降低至对照组的50%、77.5%、45%（P < 0.0001），其中H1299细胞组间差异在定量分析（下降22.5%）中显现，可能与Western blot检测灵敏度相关。

上述结果从mRNA及蛋白水平共同证实，在EGFR野生型NSCLC中CD44对PD-L1的正向调控作用。

2.4 过表达CD44后显著上调EGFR野生型NSCLC细胞系中PD-L1的mRNA及蛋白水平

图4A和4B为应用qPCR检测过表达CD44基因对EGFR野生型非小细胞肺癌细胞H1299、H460中CD44和PD-L1 mRNA表达水平的影响。如图4A所示，与对照组（Ctrl）相比，H460（P < 0.01）和H1299（P < 0.001）细胞OE-CD44组CD44基因mRNA相对表达水平明显上调，证明CD44过表达模型构建成功。通过qPCR检测过表达CD44对于PD-L1基因的表达的结果显示（图4B），经过表达处理后的H460 OE-CD44组PD-L1基因mRNA相对表达水平明显高于其对照组（P < 0.001），而在H1299细胞中，PD-L1表达量呈现升高趋势，虽然差别无统计学意义，但仍有一定的可比性，并且与预期的实验结果相符合。因此，EGFR野生型非小细胞肺癌中CD44基因对PD-L1基因很有可能存在调控作用，并且当CD44基因表达量增加PD-L1基因的mRNA表达量也会随之增加。

进一步应用Western blot及灰度分析检测过表达CD44对肺癌细胞系H460，H1299中PD-L1蛋白表达水平的影响。图4C结果显示，H460、H1299细胞OE-CD44组CD44蛋白的表达量均明显高于ctrl组，且PD-L1的表达量也明显升高。图4D对western blot灰度定量分析显示，CD44过表达处理后，H460与H1299细胞中PD-L1蛋白相对表达量分别较对照组（ctrl组）显著上调30%和60%（ P <0.000 1），表明CD44过表达可正向调控PD-L1的蛋白表达水平。

2.5 肺腺癌组织中CD274（即PD-L1）及CD44的共同高表达与肺癌病人不良预后相关

本研究基于癌症基因组图谱（TCGA）肺腺癌（LUAD）队列（n = 502），筛选原发性和复发性肿瘤样本，最终纳入354例患者进行生存分析。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线（图5），结果显示：CD274^–CD44^– 组患者的累积生存率显著高于CD274⁺CD44⁺ 组（P = 0.023）。风险比（Hazard Ratio，HR）分析进一步表明，CD274^–CD44^– 组的死亡风险较CD274⁺CD44⁺ 组降低（HR = 0.65，95% CI: 1.57-2.57），提示CD274与CD44低表达可作为肺腺癌患者预后良好的潜在生物标志物。此外，风险人数表动态显示，CD274^–CD44^–组在长期随访中（如3000 d）仍维持较高存活人数（14例），而CD274⁺CD44⁺ 组生存率随随访时间延长急剧下降，与统计学结果一致。

3 讨论

PD-L1作为已知关键免疫检查点之一，通过特异性结合PD-1受体形成免疫抑制信号轴，该信号轴通过抑制淋巴细胞增殖、减少细胞因子分泌、阻滞细胞溶解功能及延长T细胞存活期等途径，可形成肿瘤免疫逃逸的关键分子机制^[18]。临床研究表明，许多恶性肿瘤细胞通过异常高表达PD-L1配体，可显著抑制肿瘤浸润淋巴细胞的活化效能，从而逃避T细胞监视^[19]。

作为抗癌的一线防御，CD8⁺ T细胞不仅是成功癌症免疫治疗的支柱，其功能状态更直接决定免疫治疗临床应答效率，现有研究已表明，其不可逆的功能失调状态和抗原呈递机制中抗原的稀缺性都是实体瘤对免疫治疗缺乏反应的原因^[20]。基于此病理特征，通过免疫检查点抑制剂（ICI）逆转CD8⁺ T细胞的失调状态并重建抗肿瘤免疫功能，已成为当前精准免疫治疗的新型策略^[21]。值得注意的是，临床数据证实，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中PD-L1阳性患者对免疫治疗表现出更优的特异性生存率^[22-23]，NSCLC队列研究进一步验证该指标与24周无进展生存率及1年总体生存趋势的正相关性（RR = 0.96；95%CI：0.87 ~ 1.06）^[24]。这些证据确立了PD-L1作为免疫治疗反应预测标志物的临床价值。

尽管PD-L1信号轴的临床价值已被证实，但其动态调控机制仍有待进一步阐明。近期研究提示，跨膜糖蛋白受体CD44可能通过表观遗传修饰参与PD-L1表达的动态调控^[16]。在乳腺癌和肺癌的研究中^[15]，通过流式细胞术（FACS）辅助shRNA筛选证实，CD44是TNBC和NSCLC中PD-L1的新型阳性调节因子，其调控作用与PD-L1介导的肿瘤内在生物学功能密切相关。基于该调控机制的发现，本研究采用多组学验证策略，通过流式细胞术定量分析、qPCR转录水平检测及Western blot蛋白表达验证，系统证实了CD44对PD-L1表达的调控效应。

本研究前期通过siRNA介导的CD44敲低实验证实，在EGFR野生型NSCLC细胞系（H1299、H460、A549）中，CD44对PD-L1的表达具有多层次调控作用：流式细胞术定量分析表明，CD44敲低可显著降低PD-L1阳性细胞比例（P < 0.001），同时qPCR及Western blot结果证实，PD-L1 mRNA（P < 0.01）及蛋白水平（P < 0.0001）呈现同步下调趋势。值得注意的是，A549细胞中PD-L1 mRNA表达水平未达统计学差异，提示该细胞系的调控模式存在独特性。为进一步验证该调控关系的双向性，本研究构建CD44过表达模型，发现PD-L1上调呈现细胞类型特异性分化—在H460细胞中，PD-L1 mRNA（P < 0.01）与蛋白（P < 0.0001）均显著升高；而H1299细胞中仅蛋白表达上调（P < 0.0001），mRNA水平无统计学变化。

上述结果共同揭示了EGFR野生型NSCLC内部的分子复杂性：在H1299及A549细胞中，CD44可能通过转录后调控机制（如蛋白质稳定性修饰或翻译效率调控）影响PD-L1表达，所以其mRNA表达水平相对稳定，但蛋白质呈现显著变化。此外，H1299及A549细胞中mRNA与蛋白表达水平变化不一致的现象亦可能源于技术局限性，即qPCR检测的时间窗口可能未捕捉到PD-L1 mRNA表达的瞬时峰值，后续研究可通过时间梯度实验优化检测条件以排除此干扰。

本研究证实了CD44通过转录及翻译后双重调控机制维持PD-L1高表达状态，这一分子特征在EGFR野生型NSCLC中尤为显著（H460细胞mRNA/蛋白同步上调，H1299、A549细胞以蛋白稳定性调控为主）。值得注意的是，PNAS报道EGFR信号通路可能参与PD-L1的蛋白稳定性调控，结合本团队前期^[17]发现的CD44对EGFR野生型NSCLC中EGFR信号通路的调控作用，我们推测CD44可能通过维持EGFR活性进而抑制PD-L1蛋白降解，形成“CD44-EGFR-PD-L1”轴。这一假说亦可合理解释H1299及A549细胞中PD-L1 mRNA与蛋白水平变化不一致的现象—EGFR介导的翻译后调控可能在其中发挥主导作用。

（利益冲突：无）

基于TCGA肺腺癌（LUAD）队列的生存分析表明，CD274（PD-L1）与CD44共表达（CD274⁺CD44⁺ ）显著缩短患者总生存期（P =0.023），提示其作为独立不良预后标志物的临床价值。基于此，我们提出阶梯式干预策略：在CD44^high/PD-L1^high 亚群中，靶向CD44可有效降低膜表面PD-L1阳性细胞群体比例，从而增强抗PD-1/PD-L1治疗的响应率，逆转免疫抑制微环境，提高患者预后。在免疫治疗过程中，CD44表达水平可作为动态监测标志物，其持续升高可能提示获得性耐药风险，需及时调整治疗策略。这些发现为NSCLC精准免疫治疗提供了新的生物标志物体系和联合治疗靶点。

本研究仍存在以下局限：①当前实验仅基于细胞水平研究，缺乏动物模型，未来需构建CD44条件敲除小鼠模型，评估CD44缺失对PD-L1表达的影响，以增强结论的临床转化价值；②本研究提出了“CD44-EGFR-PD-L1”轴的假设，后续将通过通路抑制剂或基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）验证，明确CD44-EGFR-PD-L1轴的核心调控节点。

4 结论

在EGFR野生型NSCLC中，CD44可以正向调控PD-L1的表达。这一调控作用在转录和蛋白水平均得到验证，且具有细胞类型依赖性。本研究为联合免疫检查点抑制剂改善EGFR野生型NSCLC患者预后提供了理论依据。未来研究需进一步揭示其分子机制，并通过临床前模型验证靶向干预策略的可行性。

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基金资助

四川省科技厅项目(2023NSFSC1848)

山东省科技厅项目(ZR2021MH191)