癌组织中EPAS1、ARNT2表达水平与结直肠癌患者病理特征及预后的关系

The Relationship of EPAS1 and ARNT2 Expression in Carcinoma Tissuses with Pathological Characteristics and Prognosis of Colorectal Cancer Patients

摘要

目的 探讨癌组织中含有内皮PAS结构域的蛋白1（endothelial PAS domain protein 1，EPAS1）、芳烃受体核易位蛋白2（recombinant aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator 2，ARNT2）表达水平与结直肠癌患者病理特征及预后的关系。 方法 选取2020年8月至2022年2月我院接受手术治疗的92例结直肠癌患者，采用免疫组化法检测癌组织和癌旁组织EPAS1、ARNT2表达情况，并通过χ²检验分析EPAS1、ARNT2表达与结直肠癌病理特征的关系；采用多因素Cox回归分析预后影响因素。 结果 结直肠癌患者癌组织EPAS1阳性率为60.87%，高于癌旁组织的20.65%；癌组织ARNT2阳性率为31.52%，低于癌旁组织的77.17%（P均 < 0.05）。不同肿瘤直径、分化程度、肿瘤TNM分期、淋巴结转移及远处转移结直肠癌患者EPAS1、ARNT2表达有明显差异（P < 0.05）。92例结直肠癌患者出院后随访3年，58例患者存活，总生存率为63.04%（58/92）。肿瘤直径 < 5 cm、分化程度中/高分化、肿瘤-淋巴结-远处转移（Tumor Node Metastasis，TNM）分期Ⅰ~Ⅱ期、无远处转移、EPAS1阴性、ARNT2阳性结直肠癌患者的3年总生存率高于肿瘤直径 ≥5 cm、分化程度低分化、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、有远处转移、EPAS1阳性、ARNT2阴性患者（P< 0.05）。分化程度低分化（HR = 2.401，95% CI：1.331 ~ 4.332）、有远处转移（HR = 2.504，95% CI：1.435 ~ 4.369）、EPAS1阳性（HR = 2.989，95% CI：1.764 ~ 5.064）、ARNT2阴性（HR = 3.136，95% CI：1.847 ~ 5.324）是结直肠癌预后的独立危险因素（P < 0.05）。相关性结果显示，结直肠癌患者EPAS1表达与ARNT2表达呈负相关（C = -0.471，P < 0.001）。 结论 结直肠癌组织中EPAS1呈高表达、ARNT2呈低表达，且二者表达水平与结直肠癌患者临床病理特征及预后具有一定关系，可作为评估患者预后的潜在生物学指标。

Abstract

Objective The aim of this study was to explore the relationship between the expression levels of endothelial PAS domain-containing protein 1 （EPAS1） and aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator protein 2 （ARNT2） in cancer tissues and the pathological feature and prognosis of colorectal cancer patients. Methods A total of 92 colorectal cancer patients who underwent surgical treatment in our hospital from August 2020 to February 2022 were selected as the research subjects. The EPAS1 and ARNT2 in tissues was detected by immunohistochemistry， and the correlation between the EPAS1， ARNT2 and pathological feature of colorectal cancer was analyzed by χ² test. The patients were followed up for 3 years， and the influencing factors of prognosis in colorectal cancer patients were explored by multivariate Cox regression analysis. Results The positive rate of EPAS1 in cancer tissues of colorectal cancer patients was 60.87%， which was higher compared with adjacent tissues （20.65%）； the positive rate of ARNT2 in cancer tissues was 31.52%， which was lower compared with adjacent tissues （77.17%） （P < 0.05）. There are significant differences in EPAS1 and ARNT2 expression among colorectal cancer patients with different tumor diameter， degrees of differentiation， tumor TNM staging， lymph node metastasis， and distant metastasis （P < 0.05）. Among the 92 colorectal cancer patients， 58 patients survived after 3 years of follow-up， with a total survival rate of 63.04% （58/92）. The 3-year overall survival rate of colorectal cancer patients with tumor diameter < 5 cm， moderate/high differentiation， tumor TNM stage Ⅰ~Ⅱ， no distant metastasis， EPAS1 negative， and ARNT2 positive was higher than that of patients with tumor diameter ≥ 5 cm， low differentiation， TNM stage Ⅲ~Ⅳ， distant metastasis， EPAS1 positive， and ARNT2 negative （P < 0.05）. Low differentiation （HR = 2.401， 95% CI： 1.331 ~ 4.332）， distant metastasis （HR = 2.504， 95% CI： 1.435 ~ 4.369）， EPAS1 positive （HR = 2.989， 95% CI： 1.764 ~ 5.064）， and ARNT2 negative （HR = 3.136， 95% CI： 1.847~5.324） were independent risk factors for the prognosis of colorectal cancer （P<0.05）. The correlation results showed that the expression of EPAS1 and ARNT2 in colorectal cancer patients was negatively correlated （C = -0.471， P < 0.001）. Conclusion EPAS1 is highly expressed and ARNT2 is lowly expressed in colorectal cancer tissues， and the expression levels of EPAS1 and ARNT2 are related to the clinical pathological feature and prognosis of colorectal cancer patients， which can be used as potential biological indicators for evaluating the prognosis of patients.

Graphical abstract

关键词

结直肠癌 / 含有内皮PAS结构域的蛋白1 / 芳烃受体核易位蛋白2 / 病理特征 / 预后

Key words

Colorectal cancer / Endothelial PAS domain-containing protein 1 / Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator protein 2 / Pathological characteristics / Prognosis

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一^[1]，目前，结直肠癌的主要治疗方法是通过根治性切除术同时辅以放疗、化疗等综合手段，以提高患者生存率^[2-3]。然而，相关研究表明，尽管综合治疗手段在结直肠癌的治疗中取得了一定成效，但由于治疗耐药性、肿瘤异质性以及个体化治疗策略的局限性等因素的影响，部分患者的预后仍较差，受到临床广泛关注^[4]。因此，寻找与结直肠癌患者病理特征及预后相关的潜在生物学标志物，对于早期诊断、个体化治疗策略及改善患者预后具有重要意义。含有内皮周期蛋白-芳香烃受体核转运蛋白-单一-minded蛋白（Per-Arnt-Sim，PAS）结构域的蛋白1（endothelial PAS domain protein 1，EPAS1）是一种重要的转录蛋白，在缺氧条件下被诱导产生，广泛分布于各种类型细胞当中，其可通过调控血管生成、细胞增殖和凋亡等过程，影响肿瘤的生长和转移^[5]。有学者发现，EPAS1在胃癌组织中的表达水平高于正常组织，且其表达水平与患者多项临床病理特征密切相关^[6]。芳烃受体核易位蛋白2（recombinan t aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator 2，ARNT2）是转录因子超家族的重要成员之一，其可通过转录因子对肿瘤细胞的能量代谢、氧化应激反应及免疫微环境的调控，在肿瘤代谢和微环境调控中产生作用^[7]。已有研究表明，ARNT2表达水平在自身免疫性脑脊髓炎和少突胶质细胞成熟过程中发生显著改变^[8]。然而，至今尚未见关于EPAS1和ARNT2在结直肠癌中的表达水平及其与患者病理特征、预后关系的临床研究报道。本研究通过检测结直肠癌组织中EPAS1和ARNT2的表达水平，并分析其与患者病理特征及预后的关系，希望能为结直肠癌的早期诊断提供了新的生物学标志物，为深入理解肿瘤代谢和微环境调控机制提供理论依据和临床处治决策意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2020年8月至2022年2月河南科技大学第一附属医院接受手术治疗的92例结直肠癌患者，患者的癌组织标本纳入癌组织组（n = 92），对应癌旁组织（离肿瘤 > 5 cm）标本纳入癌旁组织组（n = 92）。本研究经河南科技大学第一附属医院伦理委员会已审批本研究（批号：202006051）。纳入标准：①病理确诊为结直肠癌^[9]；②原发结直肠癌，未接受过手术及放化疗；③临床资料完整；④患者均愿意接受随访；⑤所有患者接受同一手术团队的结直肠癌根治性切除术，术后采用以5-氟尿嘧啶为主的化疗方案；⑥患者本人或监护人签署知情同意书。排除标准：①合并除结直肠癌外的其他恶性肿瘤者；②患有肠炎病、结肠息肉者；③合并心脏、肝、肾功能及肺部重要脏器严重功能障碍者；④合并急、慢性感染性疾病或免疫系统疾病者；⑤有精神疾病或认知障碍，无法配合研究者；⑥长期服用免疫增强或抑制剂者；⑦失访或随访期间因其他疾病死亡者。

1.2 方法

1.2.1 EPAS1、ARNT2检测

通过免疫组化技术对92例结直肠癌患者的癌组织及其癌旁组织中EPAS1、ARNT2的表达情况进行评估。样本经4%中性甲醛固定、石蜡包埋后，制成4 μm厚的切片；切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，采用微波法进行抗原修复；修复后的切片用缓冲液冲洗，加入山羊血清封闭，随后分别加入艾美捷科技有限公司的鼠抗人EPAS1单克隆抗体（1∶100）和兔抗人ARNT2单克隆抗体（1∶150）于4 ℃过夜孵育；次日，切片冲洗后加入羊抗兔二抗IgG室温孵育30 min，使用DAB染色试剂盒显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片；最后，在日本Nikon C1-L光学显微镜下观察结果。

1.2.2 结果判定

采用两位病理专家双盲法评估所得结果的平均值。阳性细胞被定义为在光学显微镜下观察到的细胞质或核内有棕黄或黄色颗粒。染色评分：无色、浅黄、黄、棕黄计0、1、2、3分。阳性细胞百分比评分：阳性细胞占比0 ~ 5%、6 ~ 25%、26 ~ 50%、51 ~ 75%、 > 75%计0、1、2、3、4分。二者评分乘积 ≤ 4分阴性表达、5 ~ 12分阳性表达^[10]。

1.3 随访及预后

从结直肠癌患者出院后以电话、微信或患者入院检查等方式连续随访3年，第1年每3个月一次，第2 ~ 3年每6个月一次，随访内容为患者术后生存状况，以患者死亡或到达随访终点截止时间（2025年2月28日为随访终点），记录患者的总生存率。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计分析，计数资料以率（%）表示，EPAS1、ARNT2表达与结直肠癌临床病理特征的关系分析采用x² 检验，影响因素分析采用多因素Cox回归，计算列联系数进行EPAS1和ARNT2表达的相关性分析；P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EPAS1、ARNT2在结直肠癌患者中的表达

结直肠癌患者癌组织EPAS1阳性率为60.87%，高于癌旁组织的20.65%；癌组织ARNT2阳性率为31.52%，低于癌旁组织的77.17%（P< 0.05）。见表1、图1和图2。

2.2 不同病理特征结肠癌患者EPAS1、ARNT2表达比较

不同年龄、性别、肿瘤部位、病理类型结直肠癌患者EPAS1、ARNT2表达无明显差异（P > 0.05），而不同肿瘤直径、分化程度、肿瘤TNM分期、淋巴结转移及远处转移结直肠癌患者EPAS1、ARNT2表达有明显差异（P < 0.05），见表2。

2.3 结直肠癌患者预后情况及单因素分析

出院后随访3年，58例患者存活，总生存率为63.04%（58/92）。肿瘤直径 < 5 cm、分化程度中/高分化、肿瘤TNM分期Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴结转移、无远处转移、EPAS1阴性、ARNT2阳性结直肠癌患者的3年总生存率高于肿瘤直径 ≥ 5 cm、分化程度低分化、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴结转移、有远处转移、EPAS1阳性、ARNT2阴性患者（P< 0.05），见表3。

2.4 结直肠癌患者预后的多因素分析

以患者预后作为因变量（生存 = 0；死亡 = 1），单因素分析有差异的指标作为自变量进行多因素Cox回归分析，结果显示，分化程度低分化、有远处转移、EPAS1阳性、ARNT2阴性是结直肠癌预后的危险因素（P < 0.05），见表4。

2.5 EPAS1和ARNT2在结直肠癌表达的相关性

相关性结果显示，结直肠癌患者EPAS1表达与ARNT2表达呈负相关（C = -0.471，P < 0.001）。

3 讨论

据文献报道，结直肠癌在恶性肿瘤发病率中位居第4，病死率位居第5，对公共卫生构成了重大挑战^[11]。结直肠癌发生于大肠腺上皮细胞，主要临床表现包括腹痛、便秘、肠梗阻和体重下降等，严重影响患者的日常生活质量^[12]。结直肠癌的早期诊断面临诸多困难，癌细胞的早期转移和扩散是导致患者错过最佳治疗时机、预后不良、生存周期缩短的主要原因^[13-14]。结直肠癌的临床病理特征表现出多样性，病理特征也是评估患者预后的关键因素，然而，目前临床上尚未完全阐明与结直肠癌患者不良预后相关的发病机制，限制了针对性治疗策略的制定和预后评估的准确性^[15]。因此，探索与结直肠癌病理特征及预后相关的分子标志物具有重要意义。

EPAS1在正常生理条件下EPAS1表达较低，而在缺氧条件下EPAS1会增加表达，通过调控下游靶基因促进血管生成、糖酵解和脂肪酸氧化等代谢重编程，从而增强肿瘤细胞的适应性和侵袭能力^[16-17]。本研究发现，结直肠癌患者癌组织EPAS1阳性率更高，提示EPAS1高表达与结直肠癌发病有关；同时，不同肿瘤直径、分化程度、肿瘤TNM分期、淋巴结转移及远处转移的结直肠癌患者EPAS1表达存在差异，提示EPAS1高表达与结直肠癌肿瘤恶性程度呈正相关，EPAS1可能在多种肿瘤中具有相似的促癌机制。EPAS1高表达通过激活下游基因血管内皮生长因子的表达，增强肿瘤的血管生成能力，为肿瘤提供更多的氧气和营养，从而促进肿瘤生长和侵袭；EPAS1还可通过调节糖酵解和脂肪酸氧化等代谢途径改变肿瘤细胞的能量供应模式，增强肿瘤细胞在缺氧条件下的生存能力，进而加速肿瘤的进展^[18-19]。有研究也显示，EPAS1在宫颈癌中呈现出高表达，能促进宫颈癌细胞的恶性行为^[20]。本研究也发现，EPAS1阳性患者3年总生存率更低，且EPAS1阳性是患者预后危险因素，进而提示EPAS1可作为预测结直肠癌患者预后的潜在生物学标志物。与此同时，ISLAM等^[21]研究结果也在食管鳞状细胞癌中发现了类似的观点，EPAS1 表达水平与食管鳞状细胞癌的肿瘤位置和T分期密切相关，在食管鳞状细胞癌的发病机制中起关键作用，并可作为患者预后预测的相关标志物和治疗靶点。

ARNT2是碱性螺旋-环-螺旋-PAS转录因子家族的重要成员之一，参与调控细胞分化、代谢和应激反应等多种生物学过程^[22-23]。既往研究发现，ARNT2在胃癌中高表达可抑制肿瘤细胞的增殖，降低肿瘤的侵袭性，从而改善患者预后^[24]。本研究也发现，结直肠癌组织中ARNT2阳性率更低，提示ARNT2在结直肠癌中可能发挥抑癌作用，其低表达与结直肠癌的发生和进展密切相关，与既往研究观点类似^[25]。进一步分析ARNT2与结直肠癌临床病理特征的关系发现，不同肿瘤直径、分化程度、肿瘤TNM分期、淋巴结转移及远处转移的结直肠癌患者癌组织中ARNT2表达存在差异，这可能与ARNT2在肿瘤抑制中的多重机制有关。ARNT2作为转录因子，可通过调控下游靶基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖和存活，且ARNT2还可通过影响肿瘤微环境，抑制血管生成和基质重塑，从而降低肿瘤的侵袭和转移能力^[26]。同时，ARNT2参与了调控细胞代谢重编程，其低表达可导致肿瘤细胞代谢异常，促进肿瘤的恶性进展^[27]。本研究还发现，ARNT2阳性结直肠癌患者的3年总生存率高于ARNT2阴性患者，进而提示ARNT2的表达水平可作为评估结直肠癌患者预后的重要指标，临床可通过恢复或增强ARNT2的表达，为结直肠癌患者提供新的治疗方向，改善其预后。HAO等^[28]研究结果也表明，ARNT2在胶质母细胞瘤中表达减少，其减少可增强胶质母细胞瘤细胞在体内的生长，并影响胶质母细胞瘤患者的生存率。此外，相关性结果显示，结直肠癌患者EPAS1表达与ARNT2表达呈负相关，表明PAS1和ARNT2在肿瘤中可能存在交互作用。EPAS1和ARNT2均可与芳烃受体核转运蛋白形成异源二聚体，调控下游基因表达，通过抑制低氧诱导因子2α与ARNT的相互作用来抑制肝巨噬细胞中 低氧诱导因子2α的转录活性，是治疗非酒精性脂肪性肝炎的潜在靶点^[29]。这种交互作用在结直肠癌中的具体机制尚未明确，未来可进一步探讨EPAS1和ARNT2的协同或拮抗关系，为结直肠癌的治疗提供新的理论依据。

4 结论

结直肠癌组织中EPAS1呈高表达、ARNT2呈低表达，且二者表达水平与结直肠癌患者临床病理特征及预后具有一定关系，临床可作为评估结直肠癌患者预后的潜在生物学指标。

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基金资助

河南省医学科技攻关计划联合共建项目(LHGJ20220692)