Eya1基因S298A突变型过表达慢病毒载体的构建及其对MES23.5细胞凋亡的影响

摘要

目的构建小鼠Eya1第298位丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)的慢病毒表达载体,并探讨Eya1的298位点突变对MES23.5多巴胺能细胞凋亡的影响。方法采用PCR法、Golden Gate技术和LR反应构建携带Eya1S298A基因的慢病毒重组表达质粒。嘌呤霉素筛选稳定表达Eya1S298A的MES23.5细胞株。将稳定表达Eya1S298A或Eya1的MES23.5细胞经6-羟多巴胺处理2h,构建细胞损伤模型。CCK8法和Western blot法检测298位点突变对细胞活力和Bcl-2蛋白表达的影响。结果测序结果和PCR结果表明Eya1基因的第298位S被突变为A,Eya1S298A基因成功连接于慢病毒载体。CCK8结果表明,Eya1S298A突变组的细胞活力水平明显低于Eya1野生组(P<0.05)。Western blot结果表明,突变组Bcl-2蛋白表达水平明显低于野生组(P<0.05)。结论成功构建含Eya1S298A基因的慢病毒表达质粒,并建立稳定表达Eya1S298A的细胞株;Eya1的298位点突变降低了Eya1对MES23.5细胞的抗凋亡作用。

关键词

Eya1 / 定点突变 / MES23.5细胞 / 细胞凋亡