敲除U266细胞株VEGF-A抑制小鼠M2型巨噬细胞迁移的相关研究

摘要

目的 初步探索敲除U266细胞株中血管内皮生长因子(VEGF)-A基因及该细胞株对小鼠M2型巨噬细胞迁移的影响。方法 在无菌超净台取6～8周龄C57/B6小鼠骨髓细胞,加入20%L929细胞培养上清(提供M-CSF)的10%1640,体外培养6天左右,获得骨髓来源巨噬细胞M0(BMDMs);流式细胞术检测M0型巨噬细胞标志F4/80/CD11b;Transwell实验观察不同浓度小鼠VEGF-A对M0型巨噬细胞迁移影响;向M0巨噬细胞中加入脂多糖(LPS)、干扰素(IFN)-γ、小鼠IL-4培养48 h,获得M1、M2型巨噬细胞,流式细胞术分别检测M1、M2型巨噬细胞标志F4/80/CD16/32、F4/80/CD206;CRISPR/Cas9技术敲除U266细胞中VEGF-A,采用嘌呤霉素筛选,再用稀释法进行单克隆筛选,Western blot鉴定敲除成功细胞株,用于后续实验;将敲除成功细胞株与M2型巨噬细胞进行非接触式共培养,观察该细胞株对M2型巨噬细胞迁移影响。结果 体外诱导M0型巨噬细胞表达率为90%以上,M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞诱导表达率均为90%以上;Transwell实验结果显示不同浓度小鼠VEGF-A对M0型巨噬细胞迁移能力不全相同(P<0.05);应用Western blot技术已鉴定出VEGF-A敲除成功的U266细胞株及该细胞株能抑制M2型巨噬细胞迁移(P<0.05)。结论 在体外实验中,CRISPR/Cas9技术敲除U266细胞株中VEGF-A基因后能抑制M2型巨噬细胞迁移。因此,针对调节肿瘤相关巨噬细胞的小分子制剂可能为治疗多发性骨髓瘤提供新的思路。

关键词

多发性骨髓瘤 / 血管内皮生长因子-A / M2型巨噬细胞 / CRISPR/Cas9技术 / 迁移