大鼠Fas shRNA真核表达质粒的构建及其生物活性的鉴定

摘要

目的 构建大鼠Fas shRNA真核表达重组质粒,并检测其对NRK-52E细胞(大鼠肾小管上皮细胞)Fas基因的沉默效率,筛选出一个最有效干扰质粒。方法 按照siRNA设计原则,在大鼠Fas基因mRNA上挑选4个干扰靶序列,再根据靶序列分别设计并合成两端含有酶切位点的总长度为64 bp的shRNA转录模板DNA正、反义寡核苷酸链,并将其退火后克隆至空载体pSliencerTM3.1-H1 neo siRNA Expression Vector中,对其进行鉴定。用Lipofectamine LTX Reagent将pSilencer Fas(1～4)4个重组质粒转染至大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)内,以pSilencer-EGFP shRNA和pEGFP-N,质粒共转染做阳性对照,经过G418压力性筛选后,使用RTPCR和蛋白免疫印迹法分析针对Fas基因构建的4个重组质粒的有效性,筛选出最有效的干扰质粒。结果 pSilencer-Fas (1～4) shRNA及pSilencer-EGFP shRNA重组质粒测序结果与预期序列相同。RT-PCR及蛋白免疫印迹结果显示pSilencer-Fas4 shRNA对Fas基因在mRNA水平和蛋白水平的抑制率均最高,分别达到(78.9±3.2)%和(64.5±4.62)%。结论 利用RNA干扰技术沉默大鼠Fas基因,可以降低大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)Fas的表达。

关键词

Fas蛋白(CD95) / RNA干扰 / shRNA / 移植免疫耐受