大鼠PEDF基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

摘要

目的 构建针对大鼠PEDF基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定,探讨PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响。方法 构建PEDF基因过表达质粒,测序鉴定。针对PEDF基因不同干扰靶点构建4种RNAi病毒载体质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA,测序鉴定。过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot方法进行外源筛靶确定PEDF基因RNAi有效靶序列。有效RNAi病毒质粒和其他3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度。结果 过表达质粒及4种RNAi质粒构建成功。Western blot外源筛靶显示2个靶点能有效敲减目的基因的表达。PEDF shRNA慢病毒表达载体Serpinfl-RNAi-LV经293T细胞包装成功,收集293T细胞分泌的病毒上清测定浓缩病毒悬液的滴度为2×10¹²Tu/L。结论 成功构建了PEDF基因的RNAi慢病毒载体,为研究PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响打下基础。

关键词

PEDF基因 / RNA干扰 / 慢病毒载体