心肌缺血再灌注损伤中SRSF1介导CDK1外显子跨越促进心肌细胞衰老的作用研究

摘要

目的 探讨心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中富含丝氨酸/苏氨酸剪接因子1(SRSF1)促进心肌细胞衰老的作用及机制。方法 (1)选择40只体重250～300 g的SD雄性大鼠，随机分为假手术组、MIRI组，每组20只。假手术组开胸后暴露心脏，不做心肌缺血再灌注处理；MIRI组开胸后对大鼠心脏冠状动脉进行缺血再灌注处理。处死所有SD雄性大鼠，并使用qRT-PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western blot及β-半乳糖苷酶染色等实验检测MIRI后心肌组织损伤及衰老情况；(2)将对照组与模型组大鼠心肌组织进行二代转录组测序，研究差异基因，并将差异基因与衰老相关基因取交集；(3)构建SRSF1过表达及基因沉默慢病毒并感染人心肌细胞(AC16),使用qRT-PC、Western blot及β-半乳糖苷酶染色实验检测AC16细胞衰老情况；(4)采用半定量PCR及琼脂糖凝胶电泳检测SRSF1高/低表达情况下AC16细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)全长剪接体的表达情况；(5)选择40只体重250～300 g的SD雄性大鼠，分为对照组与SRSF1高表达组，采用qRT-PCR及Western blot检测大鼠心肌高表达SRSF1时p16及p21表达水平。结果 (1)qRT-PCR结果表明MIRI后大鼠心肌组织中肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)表达水平明显增加，ELISA证实MIRI后大鼠血清中心肌酶CK-MB及LDH表达水平增加，提示MIRI后大鼠心肌损伤；免疫组化(IHC)、qRT-PCR及Western blot结果证实MIRI后大鼠心肌组织p16及p21表达上调(P<0.05),提示心肌组织衰老；(2)对照组与模型组大鼠心肌组织二代转录组测序结果表明456个基因上调、368个基因下调，将上调基因与衰老相关基因取交集发现SRSF1是MIRI后上调的衰老相关基因；(3)qRT-PCR、Western blot及β-半乳糖苷酶染色实验表明SRSF1显著促进AC16细胞衰老；(4)半定量PCR及琼脂糖凝胶电泳证实SRSF1高表达时CDK1的5号外显子跨越，使CDK1失活，最终介导AC16细胞衰老；(5)qRT-PCR及Western blot结果证实，SRSF1高表达促进大鼠心肌细胞p16及p21表达。结论 MIRI后SRSF1上调，进而介导CDK1 5号外显子跨越，诱导心肌细胞周期阻滞，最终介导心肌细胞衰老。

关键词

细胞衰老 / 心肌缺血再灌注损伤 / 可变剪接 / 富含丝氨酸/苏氨酸剪接因子1 / 细胞周期 / 周期性蛋白依赖激酶1(CDK1)