基于HPLC指纹图谱相似度分析和化学模式识别的西藏药用麻黄品种研究

Study on the Medicinal Varieties of Xizang Ephedrae Herba Based on HPLC Fingerprint Similarity Analysis and Chemical Pattern Recognition

摘要

目的 基于HPLC图谱相似度分析和化学模式识别对西藏药用麻黄品种进行研究。 方法 HPLC采用Phenomenex luna-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A：磷酸（0.05%）-三乙胺（0.05%）水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱；柱温30℃；流速1.0 mL/min；检测波长200 nm。选取各批次麻黄药材色谱图中的主要共有峰作为变量，运用SPSS 21.0 软件进行聚类分析和主成分分析对药材进行化学模式识别。 结果 12批西藏药用麻黄HPLC指纹图谱中有8个共有峰，相似度在0.546～0.922之间；12批样品聚类分为4大类，与主成分分析结果基本一致，表现出明显的按生境聚类的特征。 结论 该方法稳定可靠，可为西藏药用麻黄品种研究和质量控制提供参考。

Abstract

Objective To research the medicinal varieties of Xizang Ephedrae Herba, HPLC fingerprint similarity analysis and chemical pattern recognition were carried out. Methods For HPLC, separation was carried out on a Phenomenex luna-C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）with a mobile phase consisting of 0.05% phosphoric acid-0.05% triethylamine aqueous solution(A) and acetonitrile(B) in a linear gradient. The column temperature was maintained at 30℃, the flow rate was kept at 1.0 mL/min, and the detection wavelength was set at 200 nm. The main common peaks in the chromatogram of each batch of ephedra were selected as variables, and SPSS 21.0 was used for cluster analysis and principal component analysis to carry out chemical pattern recognition for medicinal herbs. Results Eight common peaks were identified in 12 batches of Xizang Ephedrae Herba, with similarities ranging from 0.546 and 0.922; The 12 batches of samples were clustered into 4 categories, which was basically consistent with the results of principal component analysis, and showed obvious characteristics of clustering by habitat. Conclusion HPLC fingerprint similarity analysis combined with chemical pattern recognition could be applied to the medicinal variety identification and quality control of Xizang Ephedrae Herba due to its dependability and stability.

Graphical abstract

关键词

西藏药用麻黄 / HPLC指纹图谱 / 化学模式识别 / 品种研究

Key words

Xizang medicinal Ephedrae Herba / HPLC fingerprint / chemical pattern recognition / varieties study

引 言

麻黄是常用藏药材，藏文名为“མཚེར་ལྡུམ།”（策登木），藏医药重要典籍《四部医典》《月王药诊》《晶珠本草》《蓝琉璃》等均有记载^[1-3]。现代研究表明，麻黄具有发汗、平喘、止咳、祛痰、清热消炎、利尿、抗氧化、抗病毒、调节脂质代谢等多种功效和药理活性^[4-12]。

中药指纹图谱能够综合评价药材质量，符合藏医药整体观理论。高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography， HPLC）技术因具有强大的分离分析能力，被广泛应用于中药指纹图谱相关研究^[13-17]。不同麻黄品种具有不同的HPLC特征，因而HPLC指纹图谱可以作为评价麻黄质量的重要手段。聚类分析（Cluster Analysis，CA）和主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）等化学模式识别方法可依据某些指标对药材进行特征分析和归类，近年来广泛应用于中药材质量评价和品种研究等方面^[18-21]。

目前，《中国药典》（2025年版）收载麻黄为麻黄科植物草麻黄、中麻黄或木贼麻黄的干燥草质茎^[22]。关于以上3种麻黄的种质资源、化学成分、药理作用等方面已有较为广泛和深入的研究^[1,23-29]。但西藏地区由于特殊的地理环境且交通不便，长期以来其药用麻黄均就地取材，并非药典中标准的麻黄种类，其质量评价、质量控制等尚待深入研究。目前，关于西藏地区药用麻黄的研究较少，仅有刘灏^[1]、常子惠等^[3]、白可喻等^[4]、洪浩^[30]等对其种质资源分布和作用机制进行了初步的研究。为此，本文基于HPLC图谱相似度分析和化学模式识别进行西藏药用麻黄的品种研究，旨在为其基源鉴定、质量评价、临床应用和产品开发等提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent1200高效液相色谱仪；G1312A泵、G1315D检测器，G1300B柱温箱、Agilent Chem Station工作站；AL204分析天平（Mettler Toledo公司）、T1000型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；KH-500DB型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2 材料

13批次麻黄药材产地均为西藏，基源经张勇仓副教授鉴定（表1）。三乙胺（AR），磷酸（GR）购于北京市通广精细化工有限公司；甲醇、乙腈（皆为HPLC级）购于fisher chemical公司；盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱标准品购自中国食品药品检定研究院；实验用水均为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Phenomenex luna - C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A：磷酸（0.05%）-三乙胺（0.05%）水溶液，流动相B：乙腈；梯度洗脱（如表2），检测波长200 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样体积：20 μL。

2.2 溶液制备

供试品溶液：取西藏药用麻黄细粉0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中。加入1.44%磷酸溶液50 mL，精密称定重量，超声提取（功率500 W，频率40 kHz）50 min，冷却至室温后，再称定重量，用1.44%磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，0.22 μm滤膜滤过，取续滤液即得。

对照品溶液：分别精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱3.95 mg、3.86 mg，置于5 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，配制成浓度为0.790 mg/mL、0.772 mg/mL的对照品储备液；分别吸取适量的2种对照品储备液，用甲醇配制成含2种成分浓度为0.0790 mg/mL、0.0772 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 西藏地区药用麻黄HPLC分析

2.3.1 指纹图谱分析

按“2.2”项下法制备溶液，并依据“2.1”项色谱条件，分别分析盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱混合对照品溶液和13批次西藏地区药用麻黄的供试品溶液，记录85 min的HPLC色谱图。运用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2010A 版”对所得指纹图谱进行分析。图1展示了4号西藏麻黄药材供试品溶液及混合对照品溶液的HPLC色谱图；图2显示，10号麻黄药材供试品溶液的HPLC图谱，该图谱中未见盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱峰，明显为不合格药材，故不纳入后续指纹图谱分析；图3呈现了其余12个批次麻黄药材的HPLC指纹图谱（注：11\sim13号在指纹图谱中对应编号为10\sim12）。

在12批次西藏麻黄药材图谱中，盐酸麻黄碱峰位较居中，峰面积较大，在图谱中分离良好且为12批样品共有，以此确定盐酸麻黄碱为参照峰（S）。将所得的12批含两种生物碱的麻黄药材的HPLC指纹图谱以AIA格式依次导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2010A版”软件，以4号麻黄药材的色谱图（S4图谱）为参照图谱，时间窗宽度设置为0.1 s，进行多点校正，谱峰匹配后以中位数法生成对照指纹图谱（如图4），其中8个峰是12批样品所共有，各共有峰的保留时间如表3所示，各共有峰的峰面积如表4所示。

2.3.2 质量判断指标的制定

《中国药典》（2025年版）规定麻黄药材含盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的总量不得少于0.80%^[22]。本文中12批西藏药用麻黄中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量（如表5），除嘉黎县、亚东县的2批麻黄药材盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱总含量＜0.80%以外，其余10批药材总含量均＞3.00%，平均值为4.05%，远高于药典规定，按不低于平均值的80%制定标准^[31]，建议盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱总含量不小于3.24%作为西藏地区药用麻黄的含量测定标准。

2.4 西藏麻黄HPLC指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度

为检验方法的可靠性，精密量取4号样品溶液，重复进样6次，以参照峰的保留时间和峰面积计算，求得保留时间的RSD为0.05%~0.27%，峰面积的RSD为0.45%~2.26%。结果表明，所采用方法精密度较高。

2.4.2 重复性

精密称取4号西藏麻黄样品6份，按照“2.1”项色谱条件平行制备样品溶液，进样分析，以参照峰的保留时间和峰面积计算，求得保留时间的RSD为0.08%~0.31%，峰面积的RSD为0.61%~2.47%。结果表明，所采用方法重复性良好。

2.4.3 稳定性

为检验方法的稳定性，精密量取4号样品溶液，分别于0 h、3 h、6 h、12 h、18 h、24 h进样分析，以参照峰的保留时间和峰面积计算，求得保留时间的RSD为0.06%~0.48%，峰面积的RSD为0.51%~2.99%。结果表明，西藏地区药用麻黄供试品溶液在24 h内保持稳定。

2.5 相似度分析

西藏地区药用麻黄HPLC指纹图谱中，保留时间在75～85 min时无明显色谱峰，故选取75 min之前的色谱图进行指纹图谱的评价。以麻黄药材共有模式图谱为标准，对12批次西藏地区麻黄药材的相似度进行评价。结果显示，12批次西藏麻黄药材的相似度在0.546～0.922之间（如表6）。

2.6 聚类分析

运用SPSS 21.0 软件对12批次西藏地区麻黄药材指纹图谱进行系统聚类分析，采用组间联接法，利用欧氏距离平方作为样品的测度（如图5）。12批西藏麻黄样品聚类分为4大类，山南市及其下属的贡嘎县、扎囊县、曲松县、桑耶镇和日喀则市的定结县样品聚为1类，拉萨市两批次及其下属的堆龙德庆区样品聚为2类，山南市的洛扎县样品聚为3类，日喀则市的亚东县和那曲市的嘉黎县样品聚为4类，表现出明显的按生境聚类的特征，与刘灏等^[1]对西藏麻黄种质资源分布研究一致。

2.7 主成分分析

采用SPSS 21. 0统计软件对原始数据进行标准化处理，以主成分的特征值及贡献率为依据，对12批西藏不同产地的麻黄药材的8个共有峰进行主成分分析，选取前4个特征值＞1的成分为主成分，其累计方差贡献率为88.05%（如表7），主成分得分矩阵如表8所示。分析结果表明，前4个主成分能够有效表征其化学成分特征，可用于描述西藏麻黄药材指纹图谱信息。

以第一、第二、第三主成分为变量，得到三维投影图（如图6）。结果显示，所有样品可分为4类，该分类结果与聚类分析基本一致。

3 讨 论

3.1 西藏地区药用麻黄种属的特异性

本文所研究的西藏地区药用麻黄经鉴定主要为藏麻黄和山岭麻黄，此二者为藏医临床常用药材^[1,2]。这与国内其他地区药用麻黄主要为草麻黄、中麻黄和木贼麻黄差异较大，究其原因可能是西藏地区特殊的地理位置和高原生态环境，孕育区域特有的麻黄资源，加之历史上交通不便等因素，西藏各地区大部分药用麻黄均选择就地取材。但截至目前仍未见西藏药用麻黄品种研究和高水平质量评价的报道。有学者通过文献调研得出“麻黄在中医药中性‘温’，而藏医中性‘凉’，两者区别较大”的结论^[2]，另有研究发现藏麻黄茎中挥发性主要成分与中麻黄和木贼麻黄中已报道的挥发性主要成分不同^[3]，笔者推测这与传统药效的差异可能有一定关联。本文中13批西藏药用麻黄药材中，除来自嘉黎县、亚东县、林周县3批麻黄药材的盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱总含量小于《中国药典》（2025年版）规定的0.80%以外，其余10批药材总含量均>3.00%，远高于药典规定，而盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱为麻黄的主要药效成分^[32]，表明西藏药用麻黄具有更高含量的活性成分，临床上用药量需加以考量。藏医药学典籍《味气铁鬘》（《རོ་སྐོར་ལྕགས་ཕྲེང》）中记载麻黄“性燥、凉”；《如意宝树》（《དཔག་བསམ་ལྗོན་ཤིང》）中记载其“清新、旧热，特别能清烦热”，并指出“黑麻黄清肝热”；让钧多吉认为其“益疮，治肿瘤”；《晶珠本草》（《ཤེལ་གོང་ཤེལ་ཕྲེང》）记载其“可止血，清脾热”。^[33]而《中国药典》（2025年版）中的麻黄功能与主治为：“发汗散寒，宣肺平喘，利水消肿，用于风寒感冒，胸闷喘咳，风水浮肿。”^[22]可见藏医理论中麻黄的药效与中医存在差异，可能与两者所用不同基源麻黄药材其化学成分差异有关，但具体差异成分、药理药效及机制仍有待进一步体内外实验深入研究。

3.2 色谱条件优化与提取溶剂筛选

本文采用Phenomenex luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Zorbax C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、phenomenex Gemini-5μ C 18 110A (250 mm× 4. 00 mm，5 μm)色谱柱进行样品分析，发现Phenomenex luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱对指标成分盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱色谱峰分离度最好，且峰面积最高；分别对200 nm、210 nm、215 nm、254 nm、350 nm检测波长进行考察发现，200 nm出峰数量最多；对梯度洗脱程序考察，确定了“2.1”项下条件基线平稳，出峰完全且流动相浪费最少。分别选用水、1.44%磷酸、50%甲醇进行提取，结果表明，样品用1.44%磷酸提取后出峰数量最多，更能完整体现西藏麻黄的化学特征。

3.3 西藏麻黄药材的化学差异与标准化需求

12批西藏麻黄药材的HPLC指纹图谱相似度在0.546~0.922之间，表明因品种和产地不同，西藏麻黄药材化学成分存在明显差异。特别需要注意的是在收集的13批西藏麻黄药材中，出现了1批未见盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱但亦为西藏基层医院临床所用的药材，该批药材并未经过进一步加工，可能是一种非标准麻黄种类，其中麻黄碱和伪麻黄碱含量极低，低于HPLC检测限，也可能是自然变异导致其麻黄碱、伪麻黄碱含量降低。西藏地域辽阔，基层藏医院数量众多，这些医疗机构在临床用药实践中在中普遍存在主要依赖传统经验而缺乏系统科学依据的现象。因此，借助HPLC指纹图谱和化学模式识别等现代分析手段进行藏药材的鉴别和质量控制更显其必要性。

3.4 生境差异对西藏麻黄药材化学成分及分类的影响

聚类分析显示，生境对麻黄的化学成分及归类影响巨大。虽然同为山岭麻黄，但拉萨市及其下辖的堆龙德庆区的山岭麻黄指纹图谱却与生境相似的藏麻黄（桑耶镇、山南市、曲松县、贡嘎县和扎囊县）更为接近；洛扎县的山岭麻黄聚为3类，而亚东县、嘉黎县的山岭麻黄则聚为4类。这表明，生长环境影响西藏麻黄药材化学成分与分类，不同的生长环境由于海拔、温度、湿度等的巨大差异，西藏麻黄在化学成分和形态结构及种属亚类上都有所不同，其药效差异也有待进一步研究。主成分分析对西藏药用麻黄药材分类结果与聚类分析基本一致，皆与指纹图谱相似度分析结果相符，可以互相补充，互为佐证。

综上所述，本文基于HPLC指纹图谱相似度分析和化学模式识别对西藏药用麻黄品种进行了研究，能为西藏地区药用麻黄品种鉴定、品质评价和质量标准的制定提供科学依据，为其临床合理使用提供参考。

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基金资助

西藏自治区科技计划项目(XZ202401ZY0051)

拉萨市科技计划项目(LSKJ202413)

拉萨市区域协同创新专项计划(LSKJ202465)

西藏自治区科技重大专项(XZ202402ZD0002)