藏药喜塞尔散质量控制方法研究

Study on the Quality Control Method of Tibetan Medicine Xiser Powder

摘要

目的 建立藏药喜塞尔散的质量标准，对其质量控制方法进行研究，为喜塞尔散的质量控制提供参考。 方法 采用显微鉴别法对处方中诃子、大黄、藏木香进行鉴别；用TLC法对大黄酚、大黄素及藏木香做定性鉴别；运用HPLC，测定总大黄素以及总大黄酚的含量，同时测定结合蒽醌中的大黄素和大黄酚的总量。 结果 大黄素、大黄酚分别在11.2\sim112.0 μg/mL和19.0\sim190.0 μg/mL的浓度范围内，其峰面积与浓度之间呈现显著的线性关系，相关系数均达到0.999（r=0.999）；平均回收率分别为游离大黄素为96.42%，RSD为1.32%（n=9），游离大黄酚为100.03%，RSD为2.40%（n=9）。 结论 该方法具有操作简便、结果准确、专属性强等特点，适用于喜塞尔散的质量控制分析，可作为其质量评估的有效手段。

Abstract

Objective The aim is to establish the quality standards of Tibetan medicine Xiser powder and to study its quality control methods，providing a reference for the quality control of Xiser powder. Methods include microscopic identification of Cistanche, rhubarb, cardamom,and dried ginger in the prescription;qualitative identification of emodin, chrysophanic acid, and Tibetan cardamom through thin-layer chromatography; determination of total emodin and total chrysophanic acid in rhubarb using high-performance liquid chromatography, as well as the total amount of emodin and chrysophanic acid combined with anthraquinone. Results show that emodin and chrysophanic acid have good linear relationships with peak areas in the ranges of 11.2\sim112.0μg/ml and 19.0\sim190.0 μg/mL (r=0.999); the average recovery rates are 96.42% for free emodin with a RSD of 1.32% (n=9) and 100.03% for free chrysophanic acid with a RSD of 2.40% (n=9). Conclusion This method has the characteristics of simple operation, accurate results and strong exclusivity. It is suitable for the quality control analysis of Xiser powder and can be used as an effective means of quality evaluation.

Graphical abstract

关键词

藏药 / 喜塞尔散 / 显微鉴别，薄层色谱法 / 高效液相色谱法

Key words

Tibetan Medicine / Xiser powder / microscopic identification / TLC / HPLC

引 言

藏医学作为中华民族传统医学的重要组成部分，以其独特的理论体系和显著的临床疗效，在疾病防治领域发挥着不可替代的作用。喜塞尔散（ཞི་སེར།）是藏医临床上应用广泛的传统藏药制剂，其处方最早记载于公元17世纪藏医药学家吾金塔确编著的《纪要美饰甘露药库》。该方剂由藏木香、诃子、干姜、寒水石、大黄等十味药材精妙配伍而成^［1］，具有健胃、利胆、退黄之功效，临床上常用于治疗胆汁反流所致胃肠绞痛、胃腹胀痛，以及黄疸型肝炎、便秘等病症。现代药理研究表明，喜塞尔散中的藏木香含有挥发油成分具有调节胃肠运动、缓解痉挛的作用^［2］；诃子富含鞣质、黄酮类化合物，在抗氧化、抗炎方面表现出良好活性^［3］；大黄中的蒽醌类成分，如大黄素、大黄酚，具有泻下通便、抗菌消炎、利胆退黄等多种药理活性^［4］。上述研究为喜塞尔散的临床应用提供了一定的科学依据，但目前其质量控制的系统性研究仍较为匮乏。

当前，喜塞尔散主要作为医院制剂使用，尚未建立国家或地方层面统一的药品标准。药品质量标准是控制药品质量、保障临床用药安全有效的关键环节，缺乏规范的质量标准，可能导致药品生产过程中质量参差不齐，影响药品的临床疗效和用药安全性。近年来，随着中医药现代化进程的推进，建立科学、完善的质量控制体系已成为传统中药及民族药发展的迫切需求。对于藏药而言，如何将传统藏医药理论与现代分析技术相结合，制定出符合其特点的质量标准，是推动藏药产业规范化、现代化发展的重要课题。为填补喜塞尔散质量标准空白，提升其质量控制水平，本课题组参考《中国药典》（2020年版）、《藏药质量标准》等相关标准^［5,6］，以及近年来藏药质量控制研究的先进技术和方法^［7］，系统开展了喜塞尔散的质量研究工作。通过建立处方中主要药味的显微鉴别体系和薄层色谱鉴别方法，实现对药材基原的准确鉴定；运用高效液相色谱（HPLC）法对其主要药味大黄中的大黄素和大黄酚的含量进行测定研究，以期为喜塞尔散的质量控制提供科学、可靠的基础数据，推动该传统藏药制剂的质量标准化进程，为其临床合理应用和进一步开发提供保障。

1 仪器与试药

高效液相色谱：Waters1525型，DAD检测器；电子天平：德国赛多利斯，CPA225D Sartorius；超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司，KQ-50B型；薄层层析板（GF₂₅₄）购自青岛海洋化工厂。

供含量测定用的大黄素和大黄酚对照品由中国食品药品检定研究院提供（批号：111838-201403，110796-201621）；10批喜塞尔散为西藏自治区各医院制剂收集（表1）；甲醇（CH₃OH）、乙腈（CH₃CN）为色谱纯；自制超纯水；环己烷、乙酸乙酯、盐酸、磷酸等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

取样品粉末适量，置显微镜下观察，并与对照药材粉末显微特征进行比对。结果显示：① 诃子特征：石细胞类方形、多角形或呈纤维状，直径14\sim40 μm，长至130 μm，壁厚，孔沟细密。② 大黄特征：淀粉粒甚多，多为单粒类球形，直径2\sim45 μm，脐点星状，复粒由2\sim8分粒组成。③ 藏木香特征：菊糖可见，表面现放射状纹理（图1）。

2.2 薄层色谱鉴别

大黄^［8］：取本品粉末1 g，置圆底烧瓶中，加入25 mL甲醇-盐酸混合溶液（ V_甲醇:V_盐酸=10:1），置 80℃恒温水浴锅中回流30 min。将所得溶液过滤，收集滤液作为供试品溶液；称取大黄素和大黄酚对照品，加甲醇溶解后制得浓度为1 mg/mL的对照品溶液。参照喜塞尔散处方配比，称取除大黄外的药材，采用相同提取方法，制备阴性样品。照薄层色谱法（《中国药典》（2020年版）4部通则0502）试验^［9］，吸取供试品溶液8 μL与对照品溶液5 μL，采用微量点样器分别点样于硅胶GF₂₅₄上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸（体积比12:3:0.1）为展开剂，上行展开，取出，室温晾干，置365 nm紫外光灯下检视。各批次供试品溶液均能检测到与大黄素、大黄酚相同的R_f值的荧光斑点。斑点清晰，且无干扰（见图2）。

藏木香：取本品适量，粉碎，称取5 g，置圆底烧瓶中，加25 mL乙醚，连接冷凝管，在恒温水浴锅中回流30 min，放至室温。将所得溶液过滤并转移至旋转蒸发仪，减压浓缩至约2 mL，即得供试品溶液。另取藏木香对照药材0.1 g，加5 mL乙醚，密塞后超声提取30 min，放至室温。将所得溶液过滤并转移至旋转蒸发仪，减压浓缩至约1 mL，即得藏木香对照溶液。再精密称取土木香内酯对照品，加甲醇后制得对照品浓度为4 mg/mL的溶液。参照喜塞尔散处方配比，称取除藏木香外的药材，采用相同提取方法，制备阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中国药典》（2020年版）4部通则0502）试验^［9］，吸取供试品溶液5 μL、对照药材溶液10 μL和对照品溶液5 μL，采用微量点样器分别点样于硅胶GF₂₅₄上，以环己烷-乙酸乙酯（体积比10:1）为展开剂，连续展开两次，取出，晾干，显色剂喷5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。各批次供试品溶液均可检测到与藏木香对照药材和土木香内酯对照品相同位移的斑点，斑点清晰且无干扰（见图3）。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适应性试验^［10-19］

色谱柱为岛津C18（250 mm×4.6mm，5μm）；检测器为二极管阵列检测器；流动相为甲醇-乙腈-0.1%磷酸水（45:25:30）；流速为1.0 mL/min；柱温为30ºC；检测波长为254 nm；进样体积为10 μL。

2.3.2 溶液制备

对照品溶液的制备：精确称量大黄素和大黄酚对照品，加甲醇制得浓度为13 µg/mL的大黄素及16 µg/mL的大黄酚混合溶液，作对照品贮备液。

样品溶液1的制备方法^［20,21］：取喜塞尔散样品0.8 g，加入25 mL甲醇-盐酸混合溶液（V_甲醇:V_盐酸=10:1），精密称定总重量，置于水浴（80℃）中回流30 min后再次称重，损失的重量用甲醇补足，摇匀，滤过。精密量取2 mL续滤液，转移至5 mL量瓶中，加1 mL浓度为2%的氢氧化钠溶液，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用于测定总大黄素和总大黄酚的含量。

供试品溶液2的制备方法^[22]：精密称定喜塞尔散样品0.8 g，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 mL，称重，超声处理30 min，待冷却至室温后，再称重，并将损失的重量用甲醇补足，摇匀，滤过，取续滤液，用于游离大黄酚和游离大黄素的含量测定。

阴性对照样品溶液的配置：按照处方中各成分的配比，采用拟定的制备方法配制缺少大黄药材的阴性对照样品，取约0.8 g该样品，参照供试品溶液的制备流程，完成阴性溶液的制备。

2.3.3 方法学考察

专属性试验：精密量取“2.3.2”项下的3种溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪进行分析。结果显示，供试品溶液色谱中均能检测到大黄素及大黄酚。同时，阴性对照溶液在此位置未出现干扰峰，证明该方法具有良好的专属性（图4）。

线性关系考察：将大黄素和大黄酚贮备液，用甲醇稀释成不同浓度的对照品溶液，在“2.3.1”项下的色谱条件进行测定。横坐标表示进样浓度（µg/mL）对数，纵坐标表示峰面积对数，绘制标准曲线，得到的大黄素和大黄酚回归方程分别为：Y=45276X+688.6，R²=0.999和Y=65088X+13085，R²=0.999。结果表明，大黄素、大黄酚分别在11.2\sim112.0 μg/mL、19.0\sim190.0 μg/mL范围内线性关系良好。

精密度试验：精密量取“2.3.2”项下的两种对照品溶液，重复测定6次，每次进样10 μL。测得大黄素、大黄酚RSD分别为0.99%（n=6）和0.86%（n=6）。表明仪器精密度良好。

重复性试验：取喜塞尔散（批号01）12份，按“2.3.2”项下方法制备两种供试品溶液，精密量取10 μL，依拟定的色谱条件进样，每份供试品重复进样2次。测定总大黄素和总大黄酚、游离大黄素和游离大黄酚峰面积，计算得到的平均含量分别为0.62 mg/g、2.14 mg/g、0.61 mg/g、2.01 mg/g，RSD分别为1.21%（n=6）、0.98%（n=6）、1.04%（n=6）和1.53%（n=6），表明重复性良好，符合分析方法的要求（表2和表3）。

稳定性试验：取喜塞尔散（批号01）样品，按供试品溶液1、2制备供试品溶液。将两种溶液分别于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、10 h时间点各进样10 μL，注入液相色谱仪进行分析，记录峰面积数据。结果显示，总大黄素和总大黄酚、游离大黄素和游离大黄酚的相对标准偏差（RSD）分别为0.32%（n=6）、1.24%（n=6）、0.65%（n=6）、1.08%（n=6）。上述数据表明，10 h内供试品溶液保持良好的稳定性（表4）。

耐用性试验：依照拟定的含量测定方法，分别精密称定两份0.8 g的供试品（批号09），按供试品溶液制备方法1和制备方法2分别制备供试品溶液。分别用两个不同品牌（Waters1525型和Agilent1260型）的高效液相色谱仪进行测定。分析结果显示，各对照品色谱峰与相邻色谱峰均达到基线分离（理论塔板数>3 000，托尾因子≦1.5），相对标准偏差（RSD）值均小于2.0%。上述数据表明，该分析方法具有良好的耐用性特征，能够满足不同试验条件下的检测要求。

加样回收试验：精密称定已知含量的供试品（批号：02）约0.8 g，共9份，置具塞锥形瓶中。分别精密称定对照品含量为样品中游离大黄素和游离大黄酚含量的80%、100%、120%，加对照品后，再精密加入甲醇25 mL，按供试品溶液2的制备方法进行处理。得出的游离大黄素和游离大黄酚平均回收率及RSD测定结果见表5和表6。

2.3.4 样品含量测定

按“2.3.2”项下方法分别制备10批供试品溶液。取供试品溶液注入色谱仪中，采用既定色谱条件进行测定，记录游离大黄素和游离大黄酚、总大黄素和总大黄酚含量。通过计算总大黄素和总大黄酚的总量与游离大黄素和游离大黄酚总量之差，得出结合蒽醌中大黄素和大黄酚含量。在10批样品中，总大黄素（C₁₅H₁₀O₅）和总大黄酚（C₁₅H₁₀O₄）总量测定结果如下：含量最高值为2.84 mg/g，最低值为0.73 mg/g，平均值为1.781 mg/g；结合蒽醌中的大黄素（C₁₅H₁₀O₅）和大黄酚（C₁₅H₁₀O₄）总量测定结果如下：含量最高值为2.25 mg/g，最低值为0.14 mg/g，平均值为1.02 mg/g（表7）。

3 讨 论

3.1 显微特征选择

显微鉴别特征研究显示，虽然药材粉末中纤维组织含量丰富且特征典型，但由于此特征在诃子、大黄两种药材中均存在，故其显微特征专属性不强，有待进一步讨论和确定，且样品中的药材均为原粉入药，多种药材粉末混合后导致部分显微特征互相干扰，对质量控制带来一定挑战。为保证药品质量标准检验的可靠性，经多批次样品比对研究，最终确定诃子中的石细胞、大黄中的草酸钙簇晶和淀粉粒、藏木香中的菊糖作为喜赛尔散的典型显微鉴别指标。这些特征在该制剂中具有良好的稳定性和专属性，能够有效反映制剂组成，为药品质量控制及质量标准检验提供可靠的显微鉴别依据。

3.2 大黄展开剂选择

在大黄的薄层色谱（TCL）条件优化过程中，参照《中国药典》（2020年版）一部大黄项下相关鉴别方法，系统考察了3种不同展开剂系统，分别采用：①正己烷-乙酸乙酯-甲酸（30:10:0.5，V/V/V）；②正己烷-乙酸乙酯-甲酸（3:1:0.1，V/V/V）；③环己烷-乙酸乙酯-甲酸（12:3:0.1，V/V/V）作为展开系统，对大黄供试品溶液进行薄层色谱分离。结果显示，以第3种（环己烷-乙酸乙酯-甲酸（12:3:0.1）展开剂展开时，色谱分离效果最优，斑点圆整清晰，Rf值适宜，与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点。在该展开条件下，各成分分离度良好，可有效实现大黄特征成分的专属性鉴别，为大黄及其制剂质量控制提供可靠的薄层鉴别分析方法。

3.3 藏木香展开剂选择

在藏木香薄层色谱条件考察中，考察了两种展开剂系统：①环己烷-乙酸乙酯（10:1，V/V）；②石油醚-乙酸乙酯（10:1，V/V），并以以上两种作为展开剂进行对比试验，采用环己烷-乙酸乙酯（10:1，V/V）展开剂为展开系统时，分离效果较好，斑点圆整清晰，Rf值适宜，且与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。但进一步分析发现，阴性对照样品在与对照品异土木香内酯相应位置上出现显著蓝色斑点，对异土木香内酯的鉴定造成干扰，用4%醋酸钠制备的薄层板进行二次试验，仍无法实现有效分离，因此为确保鉴别方法的专属性，选择土木香内酯作为对照品进行鉴定。此外，对比研究了甲醇和乙醚两种提取溶媒，结果显示，乙醚作为提取溶媒时，目标成分的提取率更高，斑点更清晰，分离度更佳，整体效果较好。

3.4 检测波长的选择

检测波长的选择中，将大黄素、大黄酚混合对照品溶液在200\sim400 nm内进行全波长扫描，结果显示，大黄素在221 nm、254 nm和289 nm处呈现特征性最大吸收峰，而大黄酚在225 nm和257 nm处表现出特征性最大吸收峰。在221 nm或225 nm波长下进行检测时，杂质干扰峰较多，影响定量准确性，而在289 nm波长下，大黄酚的响应值较低，导致检测灵敏度较低。综合考虑《中国药典》（2020年版）中的相关规定，结合各波长下的吸收强度、杂质干扰程度及检测灵敏度，最终确定将检测波长设定为254 nm更为适宜。该波长下，大黄素和大黄酚均具有较强吸收，杂质干扰峰较少，能满足含量测定方法学验证中对专属性、灵敏度及准确性的要求，确保含量测定结果的可靠性与准确性（图5）。

3.5 含量指标成分及样品处理方法选择

大黄的主要成分包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚^［23,24］，《中国药典》（2020年版）^［9］将上述5种成分作为定量指标。经多批次样品测定发现，芦荟大黄素、大黄酸和大黄素甲醚的含量较低，用作定量指标误差偏大。因此，参考相关文献，以大黄素和大黄酚作为大黄的含量测定控制指标。鉴于以上两种成分在大黄中同时以游离型和结合型两种形态共存，采用甲醇作为强极性溶剂，可有效溶解游离型蒽醌，该方法操作简便、提取效率高，适用于总游离蒽醌含量的测定；针对结合型蒽醌，通过盐酸水解将其转化为游离态后，再用甲醇溶解，可测定总蒽醌（游离型+结合型）含量。在试验过程中发现，甲醇-盐酸和乙醇-盐酸两种提取体系，对供试品中总大黄素和总大黄酚的提取效率基本一致。因此，最终确定以甲醇-盐酸为供试品1的提取溶媒；用无水甲醇做供试品2的提取溶媒。

3.6 流动相的选择

在试验过程中，评估了甲醇-0.1%磷酸水溶液和甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相的适用性，但发现色谱峰存在拖尾现象。参考《中国药典》（2020年版）并经过反复优化，最终确定采用甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（45:25:30）作为流动相系统。通过对流动相比例的精细调整，证实当流动相比例为甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（45:25:30）时，大黄素和大黄酚的色谱峰形对称且尖锐，分离度良好，同时保证了适宜的分析时间。因此，最终选定甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（45:25:30）作为流动相。

3.7 方法评价

大黄素和大黄酚以游离型和结合型两种形态存在^[25]。本方法不仅测定了游离型的大黄素和大黄酚，还测定了其总量。相较于《中国药典》（2020年版）仅采用甲醇提取测定总蒽醌的传统方法，本方法虽然操作步骤较为繁琐，但可同时测定游离型蒽醌及其总量，提供更为全面的数据维度，便于深入分析游离型与结合型成分的差异。另外，在质量控制优化方面，本方法不仅有助于评估大黄药材的有效性和潜在性成分的平衡，还能精准监测不同炮制工艺对结合型蒽醌水解程度的影响，从而优化饮片质量，为药效机制的研究提供更精细的数据支撑。总之，本方法突破传统的“总量单一维度”的局限性，首次建立了“游离型+总量”双指标评价体系，显著提升了喜塞尔质量评价的科学性，为其质量控制与工艺优化奠定了基础。

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基金资助

西藏自治区重点科研项目(Z2016B01G03/01)