高寒地区豆科栽培牧草根瘤菌的分离筛选

Isolation and Screening of Rhizobium in Cultivated Leguminous Forage in Alpine Region

摘要

为获得适用于高寒生境的微生物菌剂，从高寒地区豆科牧草根际土壤中筛选高效根瘤菌，为微生物菌剂的研发和丰富根瘤菌资源库提供理论依据。选取青藏高原多年生豆科牧草种质资源圃中的6种栽培牧草，采集其根瘤样品，进行根瘤菌的分离纯化及促生特性研究。分离自黑豌豆根瘤的BWD1菌株表现出最强的固氮酶活性（457.06 nmol C₂H₄/H·mL）；分离自紫花苜蓿根瘤的ZMX1菌株的IAA分泌量最高（18.61 μg/mL）。BWD1菌株和ZMX1菌株均具有较强的固氮和产吲哚乙酸能力，可作为后续回接试验及微生物菌剂研发的候选菌株。

Abstract

The highly efficient rhizobia from was screened from rhizosphere soil of Leguminous forage plants to obtain microbial agents suitable for high-altitude habitats providing a theoretical basis for the development of microbial agents and the enrichment of rhizobia resources bank. Rhizobial samples were collected from six perennial Leguminous forage germplasm resource cultivated in the Qinghai-Tibet Plateau for the isolation, purification of rhizobia and their promoting seedling growth characteristics analysis. BWD1 strain isolated from the root nodules of black peas exhibited the strongest nitrogenase activity (457.06 nmol C₂H₄/H·mL)；while ZMX1 strain isolated from the root nodules of alfalfa had the highest IAA secretion (18.61 μg/mL). Both BWD1 and ZMX1 strains have strong capabilities on nitrogen fixation and indole acetic acid productionto be used as candidate strains for subsequent back-connection experiment and microbial agent development.

Graphical abstract

关键词

高寒地区 / 豆科牧草 / 根瘤菌 / 固氮酶活性

Key words

alpine region / leguminous forage / Rhizobium / nitrogenase activity

引 言

豆科牧草富含蛋白质、氨基酸、粗脂肪和矿质元素，并具备与根瘤菌共生、生物固氮等特性^[1]，其发达的根系结构使其能够深入土壤，通过调节气孔、激活根系生长、积累有机质、提高抗氧化酶活性以及分泌激素等多种生理机制^[2]，高效吸收水分和养分，从而增强抗旱能力^[3]。豆科牧草已成为我国北方地区主导产业之一，在草地畜牧业发展中发挥着关键作用^[4]。豆科牧草不仅极大地促进了我国畜牧业的快速发展，还具备显著的生物固氮能力，对土壤培肥和生态环境改善具有积极作用^[5]。因此，加强草地生态系统物质循环，尤其是深入研究豆科牧草的根瘤固氮是发展草地生产力的关键技术措施之一。根瘤菌（Rhizobium）是指能够与豆科植物根系相互作用，诱导形成根瘤结构的细菌类群^[6]。这些细菌既可在土壤中自由生活，也可与豆科植物互惠共生，在根瘤内进行生物固氮^[7]。多数根瘤菌属于α-变形菌纲，包括根瘤菌科（Rhizobiaceae，Sinorhizobium，Alloorhizobium，Pararhizobium，Neorhizobium和Shinella）、布鲁氏菌科（Ochrobactrum）、甲基细菌科（Methylobacterium, Microvirga）、慢生根瘤菌科（Bradyrhizobium）、黄杆菌科（Azorhizobium）和菌丝微生物科（Devosia）^[6]。

豆科植物-根瘤菌共生固氮是目前应用最广泛的生物固氮策略。豆科植物为根瘤菌提供碳源，以及在根瘤这一共生器官内进行繁殖的微环境。根瘤菌能够从植物细胞中获取必需的营养物质，并将其转化为氨，以支持其在氮限制环境下的生长^[8]。根瘤菌表现出宿主专一性，即特定根瘤菌仅能与特定种类的豆科植物形成共生结瘤^[9]。据估计，超过 65% 的生物固氮作用发生在豆科植物与根瘤菌的共生固氮中，不同豆科植物的固氮量在 80\sim500 kg/hm²·a 之间波动。充分发挥根瘤固氮作用是减少化肥用量、以较低成本显著提高植物生长、减轻能源压力及环境污染、提高土壤肥力、保障环境及畜牧业可持续发展的有效途径^[10]。有计划地拓展不同地区豆科牧草及根瘤菌的研究领域，深入研究不同种类豆科牧草的固氮能力，确定我国不同类型草地所适宜的当家豆科牧草品种及最适根瘤菌种具有重要意义^[11]。

在豆科牧草生产过程中，根瘤菌接种是一项关键技术措施。为了获得最佳接种效果，需要根据寄主植物种类和种植地气候土壤条件，选择匹配效果最佳的根瘤菌^[12]。为获得适宜高寒地区的气候和土壤条件的豆科牧草根瘤菌菌株，本研究对高寒地区6种豆科牧草根瘤进行分离纯化，通过对根瘤菌的形态观测、革兰氏染色、IAA分泌特性鉴定和固氮酶活性鉴定，从中筛选出优良的根瘤菌种，丰富根瘤菌菌株资源库，为高寒地区根瘤菌多样性的研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 研究地点

研究样地位于青海省海北州海晏县西海镇，青藏高原多年生牧草种质资源圃（E 100^°53′，N 36^°59′），占地面积100亩，海拔3 156 m，为旱作试验区，重点开展青藏高原多年生优良牧草种质资源收集整理、评价鉴定、新品种展示，以及对优良的野生牧草、抗寒耐旱牧草及放牧型牧草进行驯化和选育。西海镇地处我国西北中纬度地带，该地区植物生长期平均为143 d，温度基于-31.1℃\sim30.5℃之间，年均温0.9℃，年均日照时数2 911.5 h，年总辐射145\sim160 kcal/cm²，年平均降水量403.6 mm。春季干旱多风，夏秋季凉爽短暂，冬季漫长，干旱霜冻灾害频繁，雨热同期，无绝对无霜期。

1.2 种植布局与样品采集

1.2.1 种植布局

2020年5月5日进行田间试验布局（随机区组）及种植试验（图1），该试验区的每个小区面积为5 m×3 m（小区之间的空白处为隔离带），6种豆科牧草作为研究对象，分别为紫花苜蓿Medicago sativa L.（样品编号ZMX）、蚕豆Vicia faba L.（样品编号CD）和豌豆Pisum sativum L.（样品编号：饲用豌豆SWD；青豌豆GWD；黄豌豆YWD；黑豌豆BWD）。

1.2.2 根瘤样品采集

2020年8月17日于该种质资源圃豆科牧草试验区进行植株根瘤样品采集，在上述种植小区内，随机挖取植株根系，清除残枝落叶及余土，剪去植株地上部，将根系样品立即装入无菌自封袋，并将样品置于有冰袋的泡沫盒中带回实验室，将样品分为两份，一份用于本次试验，一份保存备用。

1.3 研究方法

1.3.1 根瘤菌的分离与纯化

参考刘振山等^[13]方法对6种豆科牧草根际根瘤进行分离纯化。首先，取新鲜且完整的根瘤，用流动自来水将其充分洗净，后用无菌水冲洗3次，并以无菌水充分浸泡根瘤近3 h使其充分膨胀，待滤纸吸干根瘤表面残留水分，用95%酒精浸泡30 s以消除其表面张力和蜡质，无菌水冲洗3次，4% NaHClO₃灭菌10 min，无菌水冲洗10次，保证根瘤表面NaHClO₃冲洗干净^[14]。随后，在无菌条件下，经消毒灭菌的根瘤用无菌刀片切开压碎，用接种环将根瘤汁液划线接入YMA培养基上，于28°C下倒置培养，2\sim4 d后观察。选择典型单一的菌落在YMA培养基（葡萄糖10 g/L、酵母提取物5 g/L、蛋白胨5 g/L、氯化钠5 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、磷酸二钠2 g/L、氯化钾1 g/L、氯化镁0.5 g/L、硫酸亚铁0.01 g/L、硫酸锰0.01 g/L、硫酸锌0.01 g/L、琼脂20 g/L）平板上反复分离直至纯化，最终用甘油冷冻法进行保存^[15]。

1.3.2 根瘤菌的形态观测

根瘤菌的形态观测：将斜面保存的根瘤菌株进行活化后，接种于灭菌的YMA培养基上，置于28℃的培养箱中培养2\sim4 d，采用培养基菌落形态轮廓分析仪及肉眼观察法，观察并记录各菌株菌落的形状、颜色、表面及边缘状况、透明度、生长速度等。

革兰氏染色：参照Solarbio革兰氏染色试剂盒G1060步骤对上述形态鉴定的菌株进行革兰氏染色，用数码显微镜DSX1000拍照截屏保存并记录。

1.3.3 根瘤菌的固氮酶活性测定

固氮酶活性测定：采用乙炔还原法^[16]：将样品密封后注入乙炔气体，于适宜条件下培养反应，再抽取气体样品用气相色谱仪分析乙烯含量以测定固氮酶活性。

1.3.4 根瘤菌分泌IAA特性测定

用分光光度法测定菌悬液OD₆₀₀值，将菌悬液离心后取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置30 min，测定其OD₅₃₀值并明确IAA产生量^[17]。将菌株接种于含L-色氨酸的LB液体培养基培养后，取菌悬液滴于白色陶瓷板并加Salkowski比色液，室温避光放置30 min后观察颜色，颜色变红则表示能够分泌吲哚乙酸^[17]。

1.4 数据处理

采用Excel进行数据的整理；用SPSS 26.0进行单因素方差分析（one-way ANOVA）、Duncan复极差异显著性检验（P0.05）；用Origin 2021进行柱状图的绘制。

2 结果与分析

2.1 根瘤菌的分离纯化

采用YMA培养基，从6种供试豆科植物根瘤中共分离得到24株生长速度快、菌落较大的优势供试菌株（表1）。其中，SWD和CD中分离的优势根瘤菌较多，ZMX和BWD中分离的根瘤菌较少。

2.2 根瘤菌的形态特征

选用YMA培养基对之前低温所保存的供试菌株进行活化，观察各菌株菌落特征（图2），除菌株SWD2a和YWD1的菌落呈黄色外，其他菌株菌落均为乳白色；23菌株菌落形态以圆形居多；菌落表面结构以微凸和凸起状况居多；表面以湿润状况居多，有部分菌株呈干燥状况，如GWD1a、GWD1b、GWD2、YWD2a、YWD2b、BWD2菌株；菌株菌落表面以光滑居多，边缘完整；除GWD1b为透明，BWD2、SWD2a、CD1b、CD2a、YWD1不透明外，其他菌株菌落皆为略透明或半透明状；生长速度除ZMX2和BWD2菌株菌落生长速度较慢外，其他菌株生长速度中等或较快；粘滞性方面，BWD2菌落不易挑，其他皆易挑；极大部分菌体形态为杆状或短杆状，仅GWD3为椭球状。

根据菌落颜色和生长状况，本研究剔除了霉菌菌株SWD2b，随后对剩余的23株未知供试菌株细胞进行革兰氏染色（表2）。镜检结果显示：根瘤菌多数菌株呈红色，为革兰氏阴性菌，中间有部分出现未被染成红色的透明节状。YWD1、GWD1a、GWD3菌株细胞革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性菌，ZMX1、ZMX2、ZMX3、BWD1、BWD2、BWD3、SWD1、SWD2a、SWD3a、SWD3b、CD1a、CD1b、CD2a、CD2b、CD3、YWD2a、YWD2b、YWD3、GWD1b、GWD2菌株革兰氏染色呈红色，为革兰氏阴性菌。

2.3 根瘤菌的固氮酶活性测定

19株供试菌株采用乙炔还原法测定了其固氮酶活性（表3）。结果表明，各供试菌株之间固氮酶活性差异较显著（P<0.05），且酶活性在85.22\sim457.06 nmol C₂H₄/H·mL之间。根据上述结果，分离自黑豌豆根瘤的BWD1、BWD2、BWD3菌株固氮酶活性最强，分别为457.06 nmol C₂H₄/H·mL、423.86 nmol C₂H₄/H·mL、445.56 nmol C₂H₄/H·mL；分离自饲用豌豆根瘤的SWD1、SWD3a菌株、分离自紫花苜蓿根瘤的ZMX1菌株和分离自青豌豆根瘤的GWD2菌株的固氮酶活性较强，分别为315.44 nmol C₂H₄/H·mL、332.60 nmol C₂H₄/H·mL、329.42 nmol C₂H₄/H·mL、386.56 nmol C₂H₄/H·mL；分离自蚕豆根瘤的CD1a菌株的固氮酶活性最弱，为85.22 nmol C₂H₄/H·mL。

黑豌豆根瘤菌在6种豆科植物中固氮酶活性最强（442.12 nmol C₂H₄/H·mL），与其他寄主植物根瘤菌具显著差异（P<0.05），紫花苜蓿、饲用豌豆和青豌豆根瘤菌次之，在255.61\sim269.86 nmol C₂H₄/H·mL之间，蚕豆根瘤菌最弱（图3）。

2.4 根瘤菌分泌IAA特性

根据比色法对供试的19株菌株的IAA分泌特性进行测定（表4）。结果显示，86.96%的供试菌株具明显分泌IAA的能力，各菌株间差异极显著（P<0.01），分泌量在0.11\sim18.61 μg/mL。分离自紫花苜蓿根瘤的ZMX1菌株的合成能力最强，为18.61 μg/mL，分离自蚕豆根瘤的CD2a、CD3菌株、分离自饲用豌豆的SWD1菌株和分离自紫花苜蓿根瘤的ZMX2 菌株IAA的合成能力较弱，分别为 0.12 μg/mL、2.15 μg/mL、1.80 μg/mL和1.91 μg/mL。

3 讨 论

豆科植物与根瘤菌的共生关系由豆科植物本身、根瘤菌以及其周围环境等因素共同决定^[18]。因此，根瘤菌的分离筛选应考虑区域环境。本研究从高寒地区豆科牧草栽培种植地中选择了紫花苜蓿、蚕豆、豌豆、饲用豌豆、青豌豆、黄豌豆以及黑豌豆等6种牧草。经过分离筛选，共获得19株根瘤菌，其中饲用豌豆和蚕豆根际中分离出的根瘤菌较多。通过乙炔还原法测定供试菌株的固氮酶活性，结果表明，即使在同一地理位置和环境条件下，采用统一栽培种植方法，不同豆科牧草植株间的固氮酶活性仍存在显著差异。与马丹丹^[19]关于吉林省长岭野外豆科牧草根瘤菌固氮酶活性的研究结果相比，本研究分离的菌株固氮酶活性较高，这可能与当地温度和光照条件有关。本研究中的豆科牧草根瘤均于2020年8月17日采集于青藏高原多年生牧草种质资源圃豆科牧草试验区，此时的温度、水分和光照条件适宜根瘤固氮^[20,21]。固氮能力的大小可能还与植株自身的生长状况及其他因素相关，有待进一步深入研究。通过测定供试菌株的固氮酶活性发现，在六种豆科植物中，黑豌豆根瘤菌的固氮酶活性最强，为442.12 nmol C₂H₄/H·mL，说明获得的3株黑豌豆根瘤菌可能为亲和力及固氮能力较强的菌株。

吲哚-3-乙酸（IAA）作为植物体内普遍存在的内源生长素，在促进植物根系发育^[22]、增强作物对水分和养分吸收^[23]、扩大根系表面积^[24]，以及稳定细胞膜结构方面发挥关键作用，进而提高植物对生物及非生物胁迫的耐受性^[25,26]。周益帆等^[22]从青菜根际土壤中筛选得到的菌株，其IAA产量可达30.05 μg/mL。万雨欣等^[27]从玉米根际土壤中分离的菌株，IAA产量高达120.66 mg/L，并具备较强的固氮能力，接种试验结果表明该菌株对玉米生长具有显著的促进效应。本研究中，分离自紫花苜蓿根瘤的ZMX1菌株表现出最高的IAA分泌量，为18.61 μg/mL，显示出较强的IAA合成潜力，但其促生效果仍需进一步验证。

传统有机肥在改善土壤结构、增加土壤肥力方面有一定作用，但往往缺乏针对性。而利用根瘤菌等植物益生菌开发的有机肥，能够根据不同植物的需求，精准提供生长所需的养分和有益微生物，提高植物对养分的吸收利用率，减少化学肥料的使用，降低农业方面的污染，实现农业的可持续发展。例如，针对特定豆科牧草开发的有机肥，可以更好地促进其生长，提高产量和品质，同时改善土壤生态环境，为其他生物的生存创造有利条件。豆科植物根瘤蕴含着丰富的根瘤菌资源，是植物-微生物共生的特殊微环境^[28]。本研究从6种豆科栽培牧草的19株供试菌株中筛选获得15株促生效果良好的根瘤菌，说明大多数豆科牧草蕴藏着重要的根瘤菌资源，发掘并利用这些微生物资源，可以更好地开发基于多功能植物益生菌的有机肥产品^[29]，促进当地草地生态畜牧业的健康发展以及生态环境的治理修复。综合来看，BWD1和ZMX1菌株的固氮能力及分泌IAA能力较强，可作为后续回接试验菌剂以及微生物菌肥的候选菌株资源，为宿主植物提供必需氮素营养^[30]，还可以为周围其他微生物和植物提供可利用氮^[31]。

以根瘤菌为核心的微生物肥料，常被用作拌种剂，大量活体根瘤菌的施用可显著促进根瘤形成^[32]，为牧草提供充足氮素，进而降低化肥投入^[33]，节约农业生产成本^[34]。在豆科牧草中接种根瘤菌不仅能增强其固氮能力，且结瘤率可提高51.10%，显著减少对氮肥的依赖，干草产量增加27%^[35]，从而缓解因氮肥过量施用导致的环境压力。此外，根瘤菌接种还有利于改善土壤肥力，促进土壤养分循环^[36]，增加土壤真菌群落多样性，降低病原菌相对丰度^[37]，最终降低农业生产的经济投入。然而，目前针对高寒地区豆科牧草根瘤菌及其相关菌剂的研究尚显不足，因此，本研究后续将进行根瘤菌的分子鉴定、回接试验、抗逆性测定以及微生物菌剂的开发。在回接试验中，可以将黑豌豆根瘤菌接种到不同的豆科植物上，观察其对植物生长的促进作用，进一步验证其固氮能力和分泌 IAA 能力的稳定性。在微生物菌肥的开发方面，可以将黑豌豆根瘤菌与其他有益微生物进行复配，制成具有多种功能的微生物菌肥，提高菌肥的效果和应用范围。通过大规模生产和推广应用黑豌豆根瘤菌菌剂和菌肥，可以为农业生产提供一种绿色、环保、高效的生物肥料，促进农业的可持续发展。

结 语

本研究共筛选得到19株根瘤菌，各菌株固氮酶活性在85.22\sim457.06 nmol C₂H₄/H·mL之间，各菌株依寄主植物间差异显著，依次为：BWD（黑豌豆）>ZMX（紫花苜蓿）>SWD（饲用豌豆）>GWD（青豌豆）>YWD（黄豌豆）>CD（蚕豆）。其中从黑豌豆中分离筛选的BWD1菌株和紫花苜蓿中分离筛选的ZMX1菌株具有较强的固氮及分泌IAA能力，可作为后续回接试验菌剂以及微生物菌肥的候选菌株资源。

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基金资助

青海大学科研实力提升项目(2025KTST06)

青海大学生态学世界一流学科生态系统演替与管理方向自主课题项目(2025-ZZ-04)