轮叶黄精与近缘种密码子偏好分析

Codon Usage Bias Analysis of Polygonatum verticillatum and Its Related Species

摘要

密码子作为连接核酸与蛋白质的桥梁，在遗传信息翻译过程中发挥关键作用，其使用偏好性体现自然选择与突变偏倚之间的动态平衡，分析密码子偏好性有助于揭示物种基因组演化及环境适应机制。文章系统分析了轮叶黄精（Polygonatum verticillatum）叶绿体密码子使用偏好性，并选取卷叶黄精（P. cirrhifolium）、多花黄精（P. multiflorum）和湖北黄精（P. zanlanscianense）3种近缘物种为对照，探讨与高海拔适应性相关的翻译层面调控机制。研究采用相对同义密码子使用频率（RSCU）、ENC值分析、中性绘图分析、PR2偏好性分析、最优密码子筛选及系统发育分析等方法，系统比较了各物种的密码子组成特征和使用模式。结果显示：（1）所有物种均表现出显著的AT末端偏好性，自然选择是驱动密码子使用偏好的主导因素；（2）卷叶黄精在特定最优密码子的使用上表现出显著增强趋势，表明其可能通过优化翻译效率以适应高原环境；（3）尽管轮叶黄精为高原物种，其密码子偏好模式更接近低海拔物种（如多花黄精和湖北黄精），未观察到其最优密码子的显著富集，推测其可能依赖非密码子使用偏好的分子机制实现高原适应。此项研究揭示了同属植物在高原适应过程中分子调控途径的多样性，为阐释高原植物的适应性演化规律提供了新视角。

Abstract

The codon usage bias in the chloroplast genome of Polygonatum verticillatum, a representative alpine species distributed in Xizang Autonomous Region, wassystematically analyzed and compared it with three closely related species of P. cirrhifolium, P. multiflorum, and P. zanlanscianense. The codon composition and usage patterns across species were examined by using a combination of Relative Synonymous Codon Usage (RSCU), ENC-plot, neutrality plot, PR2 bias analysis, optimal codon identification and phylogenetic analysis methods to explore potential translational-level regulatory mechanisms associated with adaptability of those plants to alpine environment. All species exhibited a marked preference for A/T-ending synonymous codons, suggesting a common bias shaped predominantly by natural selection. P. cirrhifolium demonstrated an enhanced utilization of specific optimal codons, implying an adaptive strategy via increased translational efficiency in response to high-altitude environments. In contrast, P. verticillatum is an also native to high altitudes, its codon usage profile closely resembled that of lowland species, with no significant enrichment of optimal codons, suggesting that it may rely on alternative non-codon-based mechanisms for adaptating to altitude. These findings reveal species-specific divergences in molecular regulatory strategies within the genus and provide new perspectives on the complex adaptive evolution of alpine plants.

Graphical abstract

关键词

黄精属 / 轮叶黄精 / 叶绿体基因组 / 密码子使用偏好性 / 高原适应性

Key words

Polygonatum / P. verticillatum / chloroplast genome / codon usage bias / adaptability to alpine

引 言

密码子作为连接核酸与蛋白质的桥梁，在遗传信息翻译过程中发挥关键作用。植物基因组中同义密码子的使用频率并非随机分布，这种现象被称为密码子使用偏好性，它反映了自然选择与突变偏倚之间的动态平衡^[1]。分析密码子偏好性，有助于揭示物种的基因组演化及环境适应机制。叶绿体基因组因其结构稳定、单亲遗传及高AT含量等特性，被认为是研究环境选择的理想模型^[2]，其密码子使用模式能够响应温度、光照等环境因子，从而体现植物对环境的适应调控策略^[3]。近年来，叶绿体基因组密码子偏好性分析已被广泛应用于高原植物的适应性研究。例如，锦鸡儿属（Caragana）植物叶绿体基因组中同义密码子的使用偏好受到强烈的自然选择压力，这种定向选择可能与其长期适应高原特殊生境密切相关^[4]；毛瓣绿绒蒿（Meconopsis torquata）通过改变叶绿体基因组中的密码子使用偏好，提升了其对高紫外线辐射与低温等极端环境的适应能力^[5]；姜科（Ginger）植物通过改变密码子使用偏好，使其在多种极端环境中维持竞争优势^[6]。这些研究表明，改变密码子使用偏好很可能是高原植物适应极端环境的重要进化策略之一。

黄精属（Polygonatum）作为百合科重要的药用植物类群，其物种分布跨越高海拔和低海拔地区，呈现显著的生态分化特征。高海拔的轮叶黄精（P.verticillatum ）、卷叶黄精 （P.cirrhifolium）表现出适应高原环境的形态特征，如叶片卷曲、角质层增厚等，并具有增强的抗氧化酶活性^[7]。分布于低海拔的多花黄精（P. cyrtonema）和湖北黄精（P. zanlanscianense）则缺乏这些高原适应特征，为研究不同海拔黄精属植物适应性提供了理想的对照体系^[8]。目前，针对黄精属植物的研究集中在药理活性和系统分类学方面^[9]。如，Shi等^[10]研究表明，黄精属植物的叶绿体基因组密码子使用在突变与自然选择的共同作用下呈现一定的偏好性；赵妍等^[11]利用质体基因组数据重建了黄精属植物系统发育关系，为黄精属分类学和种质资源研究提供了新的分子证据；陶鹏等^[12]系统分析了四川地区13种黄精属植物，并筛选出调控黄精多糖生物合成的关键酶基因，为黄精属资源质量评价及药用开发提供了分子生物学依据。然而，现有分析尚未充分考虑海拔对密码子使用模式的选择效应^[13]，特别是高原黄精属植物的密码子优化机制及其环境适应性相关研究较为缺乏，这使得黄精属植物海拔适应性的分子调控机制，尤其翻译层面的密码子优化策略仍不明确。

本研究以海拔差异显著的4种黄精属植物为对象，重点关注高原物种轮叶黄精，并以同属卷叶黄精、多花黄精和湖北黄精作为对照组，通过对各物种叶绿体基因组编码序列的密码子使用偏好性进行分析，对比评估不同海拔黄精属植物密码子使用偏好的异同，深入探讨这些差异与自然选择及突变压力之间的关系，旨在揭示轮叶黄精在叶绿体基因表达层面对高原环境的潜在适应性分子机制，丰富植物高海拔适应性进化理论，同时为高原药用植物的功能基因挖掘、分子育种与资源高效利用提供理论支持。

1 研究方法

1.1 数据来源

轮叶黄精（P.verticillatum）样品采集自西藏自治区拉萨市的自然生境（N 30.06°，E 92.15°，海拔4 135.83 m）。由西藏自治区高原生物研究所文雪梅副研究员鉴定并留存凭证标本（标本号：TB23-015）。采集的新鲜叶片经硅胶干燥后送往上海派诺森生物科技有限公司进行测序，获得的轮叶黄精叶绿体基因组序列已提交NCBI数据库（登录号：PV019483.1）。其余3种黄精属植物叶绿体基因组序列从NCBI公开数据库获取：卷叶黄精（P.cirrhifolium，登录号：MZ029092.1）、多花黄精（P.cyrtonema，登录号：MW248135.1）和湖北黄精（P.zanlanscianense，登录号：OR992390.1）。

1.2 序列筛选

通过R的Biostrings包（v2.68.0）读取并过滤叶绿基因组CDS序列，为了减少密码子偏好性分析的采样误差和冗余，同时保证数据质量，遵循以下原则筛选CDS序列进行后续分析：①排除重复基因；②剔除长度小于300 bp的CDS；③序列中不应出现终止密码子，确保序列完整；④序列以标准起始密码子（ATG）开头，并以标准终止密码子（TAG、TGA、TAA）结尾；⑤排除含有非标准碱基（非A/T/G/C）的CDS。

1.3 碱基组成分析

通过R使用getGeneticCode函数调用标准遗传密码表（代码11）获取密码子翻译表。计算各基因密码子第一、二、三位碱基的GC含量（GC₁、GC₂、GC₃）以及第三位碱基的A、T、G、C含量（A₃、T₃、G₃、C₃）。其次，使用coRdon包（v1.16.0）计算有效密码子数（ENC）和相对同义密码子使用度（RSCU）^[14]。对于每种密码子,计算其RSCU值，RSCU>1.00表示该密码子的使用频率高于平均水平，而RSCU<1.00则表示该密码子的使用频率低于平均水平。在此基础上，计算高偏好密码子的标准差（SD），SD是衡量数据点与样本均值之间离散程度的指标，计算公式如下：

SD=\sqrt[\mathrm{2}]{\frac{{\sum }_{i=\mathrm{1}}^n(x_i{-\overline{x})}^{\mathrm{2}}}{n-\mathrm{1}}}（1）

式中，x_i表示每个数据点的值，\overline{x}为样本均值，n为样本大小。

1.4 ENC-plot绘图分析

使用coRdon包计算各基因的ENC值。随后，以同义密码子第三位点的GC含量（GC3）为横坐标、ENC 值为纵坐标绘制散点图，并叠加ENC的理论期望曲线（ENC=2+GC₃s+29/[GC₃s²+(1-GC₃s)²]）。通过比较散点图中各基因实际ENC值与理论曲线代表的偏离程度，评估自然选择对密码子偏好性的影响。若密码子偏好性主要由突变偏倚驱动，数据点应沿标准曲线或其附近均匀分布；反之，若自然选择作用显著，数据点则多数分布于标准曲线下方^[15]。

1.5 中性绘图分析

中性绘图方法用于评估自然选择与突变压力对密码子使用模式的相对影响^[16]。以同义密码子第三位点GC含量（GC₃）为横坐标，密码子第一、二位点GC含量的平均值（GC₁₂=(GC₁+GC₂)/2）为纵坐标绘制散点图，并通过线性回归拟合。若GC₁₂与GC₃呈显著正相关且拟合回归斜率接近1，则三个密码子位点的碱基组成无显著差异，密码子使用偏好主要由突变压力驱动。若二者无显著相关性且斜率接近0，则表明密码子第一、二位与第三位的碱基组成存在显著差异，自然选择是密码子使用偏好的主要影响因素。

1.6 PR2-plot偏好性分析

PR2-plot图用于评估突变偏倚对密码子使用偏好的影响^[17]。以X=G₃/（G₃+C₃）为横坐标，Y=A₃/（A₃+T₃）为纵坐标绘制散点图。图中的理论中心点（0.5，0.5）表示A=T且G=C的无密码子偏好状态，同义密码子各基因点相对于中心点的偏离程度和方向反映了密码子使用的碱基偏倚特征。

1.7 最优密码子分析

以ENC值作为密码子使用偏倚的关键指标，按升序排序后分别选取首尾10%的基因构建高、低表达基因库。分别计算各密码子在两组基因库中的RSCU值，取差值ΔRSCU=RSCU高表达组-RSCU低表达组。将同时满足∆RSCU≥0.08且高表达组中RSCU>1的密码子定义为最优密码子。

1.8 系统发育分析

选取百合属(Lilium)大花百合（L.concolor，OP784245.1）、黄花百合（L.xanthellum，MN745202.1）作为外类群^[18]，并将上述4种黄精属与从NCBI下载的滇黄精（P.kingianum，MW788495.1）、独花黄精（P.hookeri，MZ150845.1）、对叶黄精（P.oppositifolium，OP428728.1）、热河黄精（P.macropodum，OP428737.1）、五叶黄精（P.acuminatifolium，MZ150867.1）、垂叶黄精（P.curvistylum，PV055066.1）以及长梗黄精（P.filipes，OL405010.1）共同构建叶绿体全基因组序列矩阵。使用MAFFT软件（v7.526）对这些基因序列构建序列矩阵并完成多重比对，随后基于FastTree软件，采用最大似然法（ML）构建系统发育树。为评估树的稳定性与置信度，对所有序列数据集进行了1 000次引导重复（Bootstrap）分析。

2 结果与分析

2.1 4种黄精属叶绿体基因组密码子组成特征

4种黄精属植物叶绿体基因组的密码子组成整体上较为保守，均呈现显著的AT偏好型倾向。4个物种的全基因组总GC含量（GC_all）均低于40%（约38.02%\sim38.07%），明显低于随机情况下50%的比例，符合被子植物叶绿体基因组整体低GC、高AT的典型特征^[19]。在不同密码子不同位点的GC含量方面，三者呈现典型的梯度分布规律：第一密码子位点GC含量（GC₁）最高（45.61%\sim45.84%），第二位点（GC₂）次之（38.34%\sim38.58%），第三位点（GC₃）最低（29.63%\sim30.23%）。以轮叶黄精为例，其GC₁约为45.64%，而GC₃显著降低至约30.16%（表1），反映出同义密码子的第三位点受到较强的选择压力而倾向于使用A或T碱基。这种GC含量的梯度分布有利于平衡密码子的稳定性与蛋白质合成效率，也体现了叶绿体基因组的低GC含量偏好。在单碱基组成方面，4个物种的碱基总体组成均以A和T占优，特别是在第三位点上A或T的比例均超过69.8%，进一步强化了密码子以A/T结尾的偏好现象。

4种黄精属均倾向于优先使用以A或T结尾的同义密码子（所有以A/T结尾的同义密码子的平均RSCU值显著高于以G/C结尾的同义密码子，P<0.001）。在所有物种中，以A/T结尾的密码子使用频率大多高于平均水平（RSCU值>1）。例如，编码苏氨酸的ACT、丝氨酸的AGT、异亮氨酸的ATT、丙氨酸的GCT以及苯丙氨酸的TTT等密码子在4物种中RSCU值均大于1，呈现高频使用倾向。这种以AT末端为主的使用模式与叶绿体基因组所携带的tRNA反密码子的种类及拷贝数高度匹配，说明翻译过程中的选择压力是驱动密码子使用演化的重要因素^[20]。尽管总体偏好模式相似，不同物种间某些同义密码子的使用频率仍存在差异（图1）。特别是卷叶黄精在高偏好密码子的使用上明显高于其他3种黄精（表2）。例如，编码丝氨酸的AGT、亮氨酸的TTA这类密码子在卷叶黄精中的RSCU值均比多花黄精和湖北黄精更高，而轮叶黄精对这些密码子的偏好程度与低海拔物种相近，并未出现类似的升高趋势，其中SD值也显示这类密码子在4种黄精属植物中的使用频率存在差异。

进一步对密码子组成各参数进行相关性分析发现，4种黄精属植物的密码子组成参数之间具有高度相关性（图2）。例如，全基因组GC含量（GC_all）与GC₁和GC₂均呈极显著正相关（r=0.71\sim0.74，P<0.001），说明基因总体GC水平与第一、二位点的GC含量同步变化。第三位点的变化对整体偏好性尤为关键：GC₃与一些指标的相关性最强，并且呈现出有规律的互补变化趋势。其中，GC₃含量与第三位点腺嘌呤含量（A₃）显著负相关（r=-0.57~-0.60，P<0.01），与第三位点胞嘧啶含量（C₃）显著正相关（r=0.73~0.74），这表明叶绿体密码子GC含量的变化主要由第三位点C替换A的比例所驱动^[20]。

2.2 ENC-plot与中性绘图分析

4种黄精属植物叶绿体基因组的ENC值结果显示（图3），各物种基因的ENC值主要分布在45\sim55之间，表明整体密码子偏好度较低，趋近于中性进化模式^[16]。大多数基因位于ENC理论中立曲线附近，支持密码子使用受“突变-选择”平衡共同调控。少数关键光合作用核心基因（如matK、psaA、psbA等）明显偏离理论曲线，表明这些基因经历了定向的密码子优化^[1]。ENC偏离程度频率分布显示（表3），大部分基因处于近中性范围（偏离值在-0.05\sim0.05之间的基因占比约45%\sim50%）。少数基因显著偏离中立模型，主要集中在rbcL等基因。这表明黄精属叶绿体基因组整体以弱密码子偏好为主，仅少数基因在特定环境或功能需求下发生适应性偏好分化。通过中性绘图分析4种黄精属植物叶绿体基因组的密码子碱基组成（图4），以GC₃为横轴、GC₁₂为纵轴进行回归拟合。结果显示，GC₁₂范围约为0.33\sim0.52，GC₃范围约为0.15\sim0.39，且回归斜率接近于0（介于0.01\sim0.05），表明GC₁₂与GC₃之间无显著线性相关。这反映了同义密码子第三位与第一、第二位碱基的组成存在显著差异。

ENC-plot与中性绘图均表明，4种黄精属植物叶绿体密码子使用偏好主要受自然选择作用的影响，而非中性突变偏差主导^[17]。高海拔物种通过选择性优化密码子使用以增强翻译效率的现象在某些基因中有所体现。例如，卷叶黄精的atpB基因GC₃含量比低海拔物种低约12%^[21]，推测其在高原环境下经历了定向选择，优化了翻译效率。轮叶黄精的回归斜率与低海拔物种无显著差异，表明其密码子组成与其他物种一致，整体未发生显著偏离。

2.3 PR2-plot分析

PR2偏好图（图5）显示，4种黄精属植物在第三密码子位点存在明显的碱基使用偏倚。其中，A₃/(A₃+T₃)均值为0.67±0.05，显著高于中性值0.5（t=12.4, P<0.001），表明该位点对碱基A具有显著偏好；G₃/(G₃+C₃)均值为0.18±0.03，显著低于0.25（P<0.001），说明整体更偏向使用碱基C，进一步反映出密码子AT末端偏好。该结果与4种植物较低的GC₃含量（约30%）相一致。其中，卷叶黄精的A₃偏向性（A₃/(A₃+T₃)=0.82）略高于其他3个黄精属，而轮叶黄精与低海拔物种相近，均接近0.65。

2.4 最优密码子分析

基于高表达基因组与低表达基因组的密码子使用频率差异（ΔRSCU），筛选出最优密码子集合（RSCU>1且ΔRSCU≥0.08）（表4）。结果显示，4个物种的最优密码子均呈现出明显的AT末端偏好特征，且SD值差别较小。这与被子植物叶绿体基因组普遍较低的GC含量特征（GC_all<38.1%）高度一致^[22]。从各物种最优密码子的组成来看，轮叶黄精的最优密码子谱与卷叶黄精和湖北黄精非常相似，共享了几乎相同的一组最优密码子（数量上均为16个，其中绝大部分以A或T结尾）。相比之下，多花黄精的最优密码子略有不同，缺失了TTA、ACC等高原物种偏好的密码子，可能是其为适应生态环境而对部分同义密码子的使用进行了不同的调整。

2.5 系统发育分析

基于最大似然法（ML）构建的系统发育树（图6），分析了10种黄精属植物的亲缘关系。树中各个节点的支持度（Bootstrap）值反映了该分支结构的可靠性。其中，黄花百合和大花百合作为外类群，构成一个支系，显示出显著的基因组差异；黄精属植物中热河黄精、独花黄精、长梗黄精和多花黄精组成一个支系；滇黄精、湖北黄精、对叶黄精、独花黄精、轮叶黄精与卷叶黄精构成一个独立支系。值得注意的是，轮叶黄精与卷叶黄精形成姐妹群关系，但节点支持度仅为53%，远低于系统发育分析常规的可靠性阈值（≥70%）。这一弱支持结果暗示两者可能存在分化事件，或基因组信号受同塑性状（如趋同进化）干扰，导致分支拓扑结构不稳定^[11]。

结 语

本研究结果表明，4种黄精属植物筛选出的最优密码子大多以A/T结尾，均表现出显著的AT末端密码子偏好性。中性图与ENC-plot分析显示，所有物种的平均ENC值低于理论中性值，且大多数基因GC₃分布偏离中立曲线，GC₁₂与GC₃之间无显著线性相关，PR2图则显示，4种物种在A/T与G/C第三位点碱基使用中存在非对称偏倚，违反了第二平行法则。表明自然选择是驱动其密码子使用偏好的主导进化力量。

高海拔严酷环境与低海拔平原环境的巨大差异在一定程度上塑造了黄精属植物的密码子使用偏好模式。高海拔常伴随低氧、强紫外线、低温和昼夜温差大等环境压力，促使植物在基因组层面采取适应性调节策略。密码子使用偏好作为翻译调控的重要环节，在适应性表达中可能发挥关键作用。卷叶黄精在最优密码子的使用上表现出显著增强趋势（例如亮氨酸TTA、丝氨酸AGT），且其PR2分析显示的更强A₃偏好性（0.82）以及关键基因（如atpB）的GC₃比低海拔物种低约12%，表明卷叶黄精通过优化密码子使用偏好以提升翻译效率，优化后的高频密码子对应更高的翻译速率和准确率^[23]，这有助于适应高原强紫外线、大温差等严酷环境。同为高原物种，轮叶黄精的密码子偏好模式（包括最优密码子、PR2偏好性A₃/(A₃+T₃)=0.65）更接近低海拔物种，未观察到最优密码子的显著富集。这表明轮叶黄精可能通过非密码子使用偏好的分子机制（如tRNA供给调控、RNA编辑或表达调节等）实现高原适应^[24]，尤其是在其偏好的林下阴湿、温差较小的微生境中。系统发育分析中轮叶黄精与卷叶黄精的弱支持节点（Bootstrap=53%）进一步印证了这一分化，二者虽为姐妹群，但低支持度显示可能存在微生境驱动的趋异演化事件，表明轮叶黄精与卷叶黄精的密码子使用偏好差异或正是它们各自微生境适应的体现^[25]。

本研究揭示了黄精属植物在高海拔适应性进化中的密码子使用偏好模式的多样性与复杂性。卷叶黄精和轮叶黄精在高海拔适应过程中，通过优化密码子使用与提升翻译效率等策略展现出独特的分子适应机制，且其密码子使用偏好的差异可能与各自微生境的特定环境压力密切相关。研究结果为理解植物在极端环境中的进化策略提供了重要的分子证据，并对未来高海拔植物的适应性机制研究具有指导意义。

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基金资助

西藏自治区自然科学基金项目(XZ202301ZR0003G)

西藏自治区中央引导地方项目(XZ202301YD0007C)