引 言
柳属（
Salix），隶属于杨柳科（Salicaceae），多为落叶的乔木或灌木，全球大约有520个种，其中青藏高原分布142种，青海省境内则有45种，且主要分布在海拔3 600 m以上、气候条件较为严酷的区域，因而形成了其抗逆性较强的特点
[1,2]。藏柳（
Salix zangica）和乌柳（
Salix cheilophila）为杨柳科柳属灌木或小乔木，生长速度快、寿命长，均能适应高寒环境，具有独特的形态特征，且分布生境相似，广泛分布于我国的西北部地区。目前，关于乌柳的相关研究较多，且主要集中在防沙治沙领域，缺乏对其低温胁迫响应机制的系统研究，藏柳树种潜力较大但相关研究相对滞后
[3-7]。因此，解析藏柳与乌柳在低温胁迫下的生理响应特征显得尤为迫切。
在柳属植物生长发育过程中，其具有一定的温度适应范围，当适应温度过低时，植物的生长发育就会受到不利影响
[8]，因此需进一步熟悉多种柳属植物的抗寒能力，对其在不同领域、环境中的应用提供策略。张捷等
[9]对旱柳（
Salix matsudana）和竹柳（
Salix Zhuliu）的抗寒性进行了研究，发现旱柳的抗寒能力远远大于竹柳。李艰等
[10]以垂柳（
Salix babylonica）为对照，分析了不同品系的竹柳的耐寒能力，发现竹柳的抗寒综合指数要高于垂柳。王凯月等
[11]分析了不同山生柳无性系在低温胁迫下叶片生理指标的变化，认为大通宝库南山的T10、大通阳山毛亥托口的T15以及班玛县赛格段的G25耐寒性较强，研究结果可为青海高海拔地区城镇植树提供科学依据。目前，关于藏柳和乌柳在极端环境下的抗逆性研究较少，杜少波等
[12]分析了藏柳和乌柳在不同干旱胁迫处理下的生理响应，发现两种柳属植物的抗旱能力均较强，其中藏柳的抗旱能力要强于乌柳，但关于藏柳和乌柳在低温胁迫处理下的生理响应还未明确。因此，本研究以藏柳和乌柳为研究对象，对其在不同的低温胁迫处理下生长性状和生理指标的变化情况进行了分析，以期为两种柳属植物的保护及资源利用等方面提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料来源
试验材料来源于湟中藏柳繁育基地采穗圃，位于青海省西宁市湟中区上新庄镇北部石城村（E 101°40′32"，N 36°62′05"），海拔2 624.5 m，年平均气温较低，夏季多雨，冬季较为寒冷，水资源主要依靠山泉水、雨水等天然水源，水质较好。采穗圃中树种存活率高达95%以上，采穗圃中的藏柳种条采自青海省玉树州藏柳繁育基地（E 97°5′57.87"，N 33°02′28.35"）。乌柳种条采自玉树州林区内（E 96°59′24"，N 33°0′36"）。参考中国植物志
[13]，依据两种柳属植物叶片的形状、质地、裂片、边缘特征和叶脉特征对其进行鉴定，并且得到了兰州大学潘建斌教授的指导，保证了分类的准确性。
1.2 试验苗木的培育
于2023年3月，取藏柳、乌柳一年生扦插苗，将健壮的扦插苗剪成上下两切口保证平滑、无伤痕，长 15 ~ 20 cm左右的插穗，插入湟中区石城村藏柳繁育基地，扦插要点及规格参考文献[
3]。待扦插苗发芽时移栽至试验花盆搬至带有顶棚的小院（温度为22.4℃）缓苗生长，苗木培育期间进行正常浇水、除草、杀虫等管理，待花盆中的移栽苗处于正常生长时（叶片舒展鲜绿，茎秆直立，根系稳固），实施低温胁迫处理。
1.3 低温胁迫处理
选取藏柳和乌柳两种无性系幼苗枝位、长势一致的叶片，先经自来水冲洗，再用去离子水冲洗，最后以滤纸吸干外附水分，用锡箔纸包裹后即刻进行低温胁迫处理。利用低温培养箱设置5个低温胁迫处理组：5℃、0℃、-10℃、-15℃、-20℃，以及对照组：22.4℃（室温），每种柳属叶片的每组处理均设3次重复。低温培养箱的光照时间为8 h，光照强度为10 000 Lux，相对湿度为80%。在对照组中，直接测定藏柳和乌柳叶片各项生理指标，在5个处理组中，降温速率为2℃/h，降温至目标温度后，分别在维持12 h、24 h、36 h后测定藏柳和乌柳叶片的各项生理指标。
1.4 测定指标
采用乙醇浸提法
[14]测定试验树种叶绿素含量；氮蓝四唑（NBT）光比色法
[14]测定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性；愈创木酚法
[14]测定过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性；考马斯亮蓝法 G-250 染色法
[14]进行试验测定树种可溶性蛋白含量（Soluble protein，Sp）；茚三酮比色法
[14]测定脯氨酸（Proline，Pro）含量；硫代巴比妥酸法
[14]测定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量；蒽酮比色法
[14]测定可溶性糖（Soluble sugars，Ss）含量。
1.5 数据处理
使用Microsoft Excel对试验数据进行整理并制作图表；使用IBM SPSS Statistics 23软件对数据进行ANOVA分析，Duncan检验显著性差异。
2 结果与分析
2.1 低温胁迫对叶绿素含量的影响
如
图1所示，在12 h、24 h、36 h三种低温胁迫时间下，随着胁迫温度的降低，藏柳叶片总叶绿素含量呈先上升后下降的趋势，乌柳叶片总叶绿素含量总体呈下降趋势，均在-20℃时总叶绿素含量达到最低值；在同一低温胁迫处理下，两种柳属植物在低温胁迫12 h后的叶片总叶绿素含量均低于其他低温胁迫时间。表明随着低温胁迫温度的降低，藏柳和乌柳叶片的总叶绿素含量总体呈下降趋势，并且在进行低温胁迫的短时间内，其叶片总叶绿素含量降低得更为明显（
图1）。
2.2 低温胁迫对超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响
与对照组相比，在低温胁迫24 h和36 h后，胁迫处理组下的藏柳叶片SOD活性均有下降趋势，在低温胁迫12 h后叶片SOD活性变化较小（
图2A）。与对照组相比，在-20℃的低温胁迫36 h后，乌柳叶片SOD活性下降幅度较大，其余两种低温胁迫时间下，叶片SOD活性变化较小（
图2B）。在对照条件下，乌柳SOD活性高于藏柳。
2.3 低温胁迫对过氧化物酶（POD）活性的影响
与对照组相比，三种低温胁迫时间下，各个低温胁迫处理均增加了藏柳叶片的POD活性，且低温胁迫时间越长，叶片POD活性的增加幅度越小（
图3A）。与对照组相比，在低温胁迫12 h和24 h后，各个低温胁迫处理均增加了乌柳叶片的POD活性，在低温胁迫36 h后，乌柳叶片POD活性随着胁迫温度的增加呈先上升后下降再上升再下降的趋势（
图3B）。从
图3中还可以发现乌柳叶片在低温胁迫处理下，其POD活性的增加幅度远高于藏柳。
2.4 低温胁迫对可溶性蛋白（Sp）含量的影响
与对照组相比，三种低温胁迫时间下，藏柳叶片的Sp含量除个别情况外普遍呈增加趋势，仅在低温胁迫36 h后，生存温度为5℃的低温胁迫处理下，藏柳叶片的Sp含量下降，但下降幅度相对较小（
图4A）。乌柳在低温胁迫处理下，其叶片Sp含量变化与藏柳相似，在低温胁迫处理下，叶片Sp含量呈增加趋势，但在低温胁迫12 h后，生存温度为5℃和0℃的低温胁迫处理下，乌柳叶片的Sp含量下降，但下降幅度也相对较小（
图4B）。
2.5 低温胁迫对脯氨酸（Pro）含量的影响
由藏柳和乌柳在低温胁迫下的叶片Pro含量的变化情况可知（
图5），与对照组相比，三种低温胁迫时间下，在各个低温胁迫处理下的叶片Pro含量变化幅度较小，说明低温胁迫对乌柳和藏柳叶片的Pro含量影响较小。
2.6 低温胁迫对丙二醛（MDA）含量的影响
三种低温胁迫时间下，藏柳叶片中的MDA含量随着生存温度的下降大致呈现先下降后上升的趋势（
图6A）。三种低温胁迫时间下，乌柳叶片中的MDA含量随着生存温度的下降呈上升趋势，这与藏柳叶片中MDA含量的变化不同，且在三种低温胁迫时间下，在生存温度为-20℃时叶片中的MDA含量均达到最高（
图6B）。
2.7 低温胁迫对可溶性糖（Ss）浓度的影响
三种低温胁迫时间下，藏柳和乌柳叶片Ss浓度随着生存温度的下降大致呈下降趋势（图7）。藏柳在同一胁迫处理下，三种低温胁迫时间对其叶片Ss浓度影响相似（图7A），而乌柳在同一胁迫处理下，三种低温胁迫时间下的叶片Ss浓度由大到小排名均为36 h24 h12 h（图7B）。此外，在低温胁迫下，藏柳叶片的Ss浓度的下降幅度大于乌柳。
3 讨 论
3.1 低温胁迫对叶绿素含量的影响
叶绿素可以吸收和传递光能，并将其转化为植物所需的能量，从而保障植物正常生长发育。当植物处于低温环境时，叶绿素结构首先会遭到破坏，进而导致植物叶绿素含量下降
[15]。冯峻等
[16]研究证明，华山松随着胁迫温度的下降，其不同无性系幼苗叶片叶绿素含量整体呈下降趋势。本研究也发现，随着胁迫温度的降低，乌柳叶片总叶绿素含量呈下降趋势，这是由于在低温环境下，植物体代谢缓慢，合成叶绿素的原料不足，导致叶绿素含量降低
[17]，而藏柳叶片随着其胁迫温度的降低，总叶绿素含量呈先上升后下降的趋势，这可能是由于低温胁迫的温度相对较高时，藏柳叶片还能发挥出较强的抗逆性，促进了叶绿素的合成来应对低温；而当低温胁迫的温度较低时，其抗逆性减弱，使叶绿素的结构破坏量高于合成量，进而使其叶绿素含量降低。本研究还发现，在低温胁迫下的短时间内（12 h），藏柳和乌柳叶片的总叶绿素含量更低，这与高敏等
[18]研究中低温胁迫对柠条锦鸡儿幼苗叶片叶绿素含量的影响结果一致，导致这种现象的原因可能是在低温胁迫长时间后，柳属植物的抗逆性增强，抑制了叶绿素含量的减少。
3.2 低温胁迫对保护酶活性的影响
在低温胁迫下，细胞内会产生更多的活性氧，从而使膜系统遭到损害，而SOD和POD是植物酶促防御系统中的重要保护酶，可以减轻膜脂过氧化，稳定细胞膜透性。其中，SOD可以清除过多的活性氧自由基转化为H
2O
2，从而保护细胞膜和DNA免受氧化损伤
[19-21]。POD是植物体内广泛存在而重要的保护性氧化还原酶，可以清除细胞内的H
2O
2，防止细胞内代谢中间产物的过度积累，避免产生对细胞的伤害
[22]。因此，SOD和POD活性可以通过相互协调的作用，来帮助植物应对低温环境。本研究发现，乌柳在低温胁迫下其叶片SOD活性变化幅度较小，且维持着较高的酶活水平，这与王珺等
[23]的研究结果类似，而藏柳叶片在低温胁迫24 h和36 h后，SOD活性下降，因此从SOD活性变化水平来看，低温胁迫对藏柳带来的伤害更大。在低温胁迫下，藏柳和乌柳叶片的POD活性变化幅度较大，随着胁迫温度的下降，POD活性总体呈上升趋势，这与冯峻等
[16]研究结果不同，这可能是由于其所研究的植物对象或低温胁迫的温度不同，从而导致对叶片中的POD活性做出了不同的响应程度，表明藏柳和乌柳在低温胁迫下可能通过增加POD活性来应对低温环境。此外，乌柳叶片的POD活性的增幅远高于藏柳，表明乌柳可能通过特定POD基因的高效转录表达，或其编码酶蛋白更优的低温适应性（高催化效率、强结构稳定性），最终表现出更高的POD活性增幅，从而增强低温胁迫下的抗氧化能力。因此，从POD活性的变化来看，乌柳的耐寒能力要强于藏柳。综上所述，在低温胁迫下，藏柳和乌柳叶片的SOD活性并没有明显增加，导致其叶片产生更多的活性氧，对膜系统造成损害，但POD活性大幅度增加，进一步缓解了H
2O
2的过度积累，减少了对膜的损伤程度，并且从保护酶活性的变化上来看，乌柳的耐寒能力可能要强于藏柳。
3.3 低温胁迫对渗透调节物质的影响
在应对逆境时植物渗透调节物质发挥着关键作用，这些物质包括可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白等，它们能够主动激活渗透调节、维持膜系统和蛋白质稳定等多种防御机制，与植物抗寒抗冻能力紧密相关
[24,25]。本研究发现，在低温胁迫下，藏柳和乌柳的可溶性蛋白含量增加，可溶性糖浓度下降，脯氨酸含量变化较小。相关研究
[26，27]发现，低温条件下，植物机体的可溶性蛋白含量上升，这与本研究结果一致。邱喜岩等
[28]研究表明，低温胁迫会使中国南瓜苗可溶性糖含量升高。而本研究发现，在低温胁迫下，藏柳和乌柳的可溶性糖浓度下降，这同样是由不同种类的植物抗寒能力及机制不同所致，随着藏柳和乌柳叶片的可溶性糖浓度降低，其作为能量底物和降低植物组织冰点等功能相应减弱
[25]，从而对藏柳和乌柳产生伤害。在低温胁迫下，藏柳和乌柳的脯氨酸含量变化较小，表明温度可能不是影响藏柳和乌柳脯氨酸含量的主要因素。因此，只对于渗透调节物质来说，本研究中的藏柳和乌柳两个柳属植物主要通过提升可溶性蛋白含量来抵抗寒冻。在三种胁迫时间下的同一胁迫处理中，乌柳的可溶性蛋白含量和脯氨酸含量要高于藏柳，且在低温胁迫下藏柳的可溶性糖浓度下降幅度更大，表明在受到低温胁迫后，藏柳所受到的伤害更大。因此，从低温胁迫对渗透调节物质的影响结果来看，乌柳的耐寒能力较强于藏柳。
3.4 低温胁迫对丙二醛（MDA）含量的影响
植物在遭遇低温胁迫时，膜脂过氧化产物MDA会大量积累，而MDA的积累会对细胞膜造成伤害
[29]。因此，MDA含量可以反映细胞所受到的损伤程度，其含量越大则细胞受到的损伤程度越高
[30,31]。赵文武等
[32]研究发现，低温胁迫下葛藤幼苗的MDA含量增加，这与本研究中乌柳在遭受低温胁迫下其MDA含量变化一致。但藏柳在遭受低温胁迫时，其MDA含量随着胁迫温度的下降呈现先下降后上升的趋势，这可能是由于在胁迫温度还维持在较高水平时，藏柳还具有一定的抗逆性，抑制了MDA含量的上升，而当胁迫温度较低时，藏柳的抗逆性减弱，使MDA含量又呈增加趋势。从藏柳和乌柳的总叶绿素含量和MDA含量变化来看，这两种柳属植物在低温胁迫下所产生的响应特征存在差异，Revilla等
[33]研究表明，近缘物种的耐寒性差异可能源于其遗传背景驱动的代谢调控特异性。因此，今后需要深入探讨分析柳属植物的遗传机制，进一步揭示柳属植物的抗寒机制。
结 语
低温胁迫会显著降低藏柳和乌柳叶片的总叶绿素含量与可溶性糖浓度，同时提高POD活性及可溶性蛋白含量，对脯氨酸含量的影响则相对微弱。综合叶片保护酶活性与渗透调节物质含量的变化规律来看，乌柳的抗寒能力要优于藏柳。本研究仅以离体叶片为研究对象，而离体组织与整体植株在低温胁迫下的生理响应特征存在差异。因此，后期将以完整植株为材料，结合试验进一步验证两种植物的抗寒差异及生理机制，为抗寒植物资源筛选与应用提供更全面的理论支撑。
昆仑英才•高端创新创业人才计划特色人才项目“领军人才”(1003-005024011)
青海省自然科学基金项目(2023-ZJ-908M)
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