4种柳树的叶片差异代谢物分析

Analysis on Differential Metabolites of Leaves From Four Willow Species

摘要

利用液相色谱串联质谱技术（LC-MS/MS），并结合主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）代谢组学方法，筛选江达柳（Salix gyamdaensis）、巴郎柳（S.sphaeronymphe）、川滇柳（S.rehderiana）、白柳（S.alba）4种柳树叶片的差异代谢物并分析其代谢通路。结果显示：4种柳树的叶片中共检测到17类3 427种化合物，主要化合物为黄酮类化合物、有机氧化合物、异戊烯醇类脂质、脂肪酰类化合物等。江达柳与巴郎柳、川滇柳、白柳间差异代谢物分别有572个、586个、549个；巴郎柳与川滇柳、白柳以及川滇柳与白柳间差异代谢物分别有586个、602个、532个。4种柳树叶片化合物和差异代谢物以黄酮类化合物为主，差异代谢物主要富集在苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成等途径上。

Abstract

Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was employed for profiling metabolites in Leaves of Four Willow Species. Principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) were subsequently applied to identify differential metabolites across species and to investigate associated metabolic pathways. A total of 3 427 compounds in 17 categories were identified in the leaves of the four willow species. The primary compounds included Flavonoids, Organic oxides, Isoprenoid alcohol lipidsand Fatty acyl compounds. There were 572, 586 and 549 differential metabolites between Salix gyamdaensis and S.sphaeronymphe, S.rehderiana, S.alba, respectively. There were 586, 602 and 532 differential metabolites between Salix sphaeronymphe and S. rehderiana, S.albaS.rehderiana, and S.alba, respectively. The major metabolites identified in the leaf of four willow species were Flavonoids, and the differential metabolites were predominantly enriched in metabolic pathways such as Phenylpropanoid biosynthesis, Flavonoid biosynthesis,Flavone and flavonol biosynthesis. This study provides insights and theoretical support for the comprehensive development and utilization of Salix L. resources in high-altitude environments.

Graphical abstract

关键词

柳树 / 液相色谱串联质谱技术 / 代谢组学 / 代谢物差异

Key words

willow / LC-MS/MS / metabolomics / metabolite differences

引 言

柳属（Salix L.）是杨柳科（Salicaceae）中的一个类群，广泛分布于植物界，是极为重要的植物分类群之一。当前全世界共有520余种柳属植物，集中分布在北半球的温带和寒带地区，少数种分布在南半球的热带地区^[1,2]。青藏高原作为现代柳属资源的重要分布中心之一，主要分布在祁连山区和青南高原东部地区，并形成了适应高寒和干旱环境的分布和区系特征。柳属植物具有耐寒、耐旱等特性，其适应性强，在生态系统中具有重要的作用^[3-6]。柳属植物化学成分丰富，含多种酚类次生代谢产物，包括黄酮类（flavonoids）、缩合单宁（condensed tannins）以及该属特征性的水杨酸苷类（salicinoids）化合物^[7-11]，这些次生代谢产物在植物生理学和药用功能中起着关键作用^[4]。

然而，以往对柳属植物的化学研究，多集中于特定物种的化学成分分离鉴定或少数经济物种的育种与抗性评价^[12-14]。尽管此类研究已积累了较为丰富的代谢物化学数据，但研究体系中对柳树遗传背景的解析仍存在明显不足。遗传背景是驱动物种间代谢组分化、决定代谢特征差异的核心因素。已有研究发现，旱柳和垂柳的枝条硬度不同，是由于纤维素合成酶基因（CesA）在染色体上的位置和结构发生了变异，最终影响了细胞壁厚度和纤维素含量^[15]。此外，转录组层面的研究也表明，同一物种在细胞过程、代谢过程、信号转导等功能类别上存在差异表达基因，这些遗传差异为代谢物分化提供了分子基础^[16-18]。

江达柳（Salix gyamdaensis）、巴郎柳（S. sphaeronymphe）、川滇柳（S. rehderiana）、白柳（S. alba）均属于杨柳科（Salicaceae）柳属（Salix L.）植物，灌木或乔木，主要产于我国西藏、青海、甘肃、云南、四川等地区，生长于海拔1 400～4 000 m的山坡、山脊、林缘及灌丛和山谷溪流旁^[19]。本研究团队前期对青藏高原柳属种质资源进行了大量踏查，运用形态学和遗传学的手段，综合形态与分子研究数据，发现青海林场苗木培养基地以及青海玉树、西藏昌都、西藏墨脱等地区栽培的藏柳（俗称）并非严格意义上的单一物种，可能来自江达柳、巴郎柳、川滇柳、白柳等多个近缘及同属物种。目前，针对青藏高原柳属资源的研究仍以扦插育苗、无性系扩繁、田间栽培管理等基础应用技术研究为主^[20,21]。为进一步深化对高原柳属植物的系统认知，亟须向分子机制等层面开展拓展研究。

本研究选取以上4种柳树为实验材料，利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）联用技术，探究不同柳树叶片中代谢物的种类组成及含量分布特征，阐明其代谢物谱的变化规律与种间差异，不仅能够系统揭示柳属植物在极端环境下的代谢多样性及其适应机制，还能为高原植物资源的功能挖掘、生态保护与可持续利用提供关键科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

于2024年6月底在青海省班玛县玛可河林场（E 101°1′14.50″，N 32°39′59.99″）采集巴郎柳、白柳、川滇柳、江达柳等柳属植物样品。巴郎柳、白柳、川滇柳、江达柳群落盖度达80%左右，适应性强，生境多样，见于山坡、林缘、灌丛、溪旁；海拔1 400～3 700 m，花果期5—7月。每种样品在样点进行3～5次采集，样品浸入液氮保存并带回实验室，保存于-80℃冰箱。为保证柳属种类的准确性，实验材料经兰州大学潘文斌教授鉴定为杨柳科柳属植物江达柳（Salix gyamdaensis）、巴郎柳（S. sphaeronymphe）、川滇柳（S. rehderiana）、白柳（S. alba）。代谢组学分析由上海拜谱生物科技有限公司完成。

1.2 仪器与试剂

Q Exactive Plus质谱仪、SHIMADZU-LC30超高压液相色谱仪、ACQUITY UPLC® HSS T3色谱柱（2.1×100 mm, 1.8 µm）、Bioruptor超声波系统、Concentrator plus真空离心浓缩仪、Centrifuge 5424R离心机。

乙腈（批号：1.00030.4008，纯度99%）；甲醇（批号：1.06007.4008，纯度99%）；氨水（批号：105426，纯度99%）；甲酸（批号：111670，纯度99%）。

1.3 代谢物提取

样品于4℃解冻，4种样品分别从液氮取出研磨，每组6个重复，每样称取50 mg，加2颗钢珠，加入400 μL预冷的甲醇-水（4:1，v/v）溶液，在组织破碎仪中低温匀浆破碎，加入600 μL预冷的甲醇-水（4:1）溶液，混匀，冰浴中超声20 min，-20℃静置1 h，16 000 g 4℃离心20 min取上清，上清液在高速真空浓缩离心机挥干。质谱检测时加100 μL预冷的甲醇-水（1:1）溶液复溶，20 000 g 4℃离心15 min，取适量上清进样分析。

1.4 LC-MS/MS 分析

1.4.1 色谱分离

整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中，样品采用SHIMADZU-LC30超高效液相色谱系统（UHPLC），使用ACQUITY UPLC® HSS T3（2.1×100 mm，1.8 µm）色谱柱。其中进样量4 µL，柱温40℃，流速0.3 mL/min；色谱流动相A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈；色谱梯度洗脱程序如下：0～2 min，0 B；2～6 min，B从0%线性变化至48%；6～10 min，B从48%线性变化至100%；10～12 min，B维持在100%；12～12.1 min，B从100%线性变化至0%，12.1～15 min，B维持在0%。

1.4.2 色谱分离

每例样品分别采用电喷雾电离（ESI）进行正离子（+）和负离子（-）模式检测。样品经 UPLC 分离后用 QE Plus 质谱仪（Thermo Scientific）进行质谱分析，使用HESI 源进行离子化，其离子化条件如下：Spray Voltage：3.8 kv（+）和3.2k v（-）；Capillary Temperature：320（±）；Sheath Gas：30（±）；Aux Gas：5（±）；Probe Heater Temp：350（±）；S-Lens RF Level：50。质谱采集时间：15 min。母离子扫描范围：75～1 050 m/z，一级质谱分辨率：70 000@m/z 200，AGC target：3e6，一级 Maximum IT：100 ms。二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描（full scan）后触发采集10个最高强度母离子的二级质谱图谱（MS2 scan），二级质谱分辨率：17 500 @ m/z 200，AGC target:1e5，二级 Maximum IT：50 ms，MS2 Activation Type: HCD，Isolation window：2 m/z，Normalized collision energy（Setpped）：20，30，40。

1.5 数据处理

原始数据采用MSDIAL软件进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配（质量偏差mass tolerance 10 ppm）和二级谱图匹配（质量偏差mass tolerance0.01 Da）的方式，检索 HMDB、MassBank、GNPS等公共数据库及自建代谢物标准品库（BP-DB）。使用SIMCA 14.1软件进行PCA分析和OPLS-DA分析；使用MS-DIAL 软件对质谱峰进行修正；利用KEGG数据库对差异代谢物进行通路富集分析。

2 结果与分析

2.1 4种柳树叶片代谢组学分析

将质量控制（QC）样本正、负离子检测模式下的质谱总离子流图（Base Peak）分别进行谱图展示比较，正离子模式下Base Peak图谱如图1所示，负离子模式下Base Peak图谱如图2所示。结果表明，各色谱峰的响应强度和保留时间基本一致，说明整个实验过程中仪器误差引起的变异较小，数据质量可靠。在江达柳、巴郎柳、川滇柳、白柳4种柳树中检测到3 427个代谢化合物，化合物分类结果如表1所示，主要有苯及取代衍生物、羧酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、香豆素及其衍生物、脂肪酰类化合物、黄酮类化合物、咪唑并嘧啶类、吲哚及其衍生物、异黄酮类、有机氮化合物、有机氧化合物、酚类化合物、异戊烯醇类脂质、甾体及甾体衍生物、苯并吡喃类、吡啶及其衍生物和其他化合物共17类，说明江达柳、巴郎柳、川滇柳、白柳4种柳树叶片含有丰富的化合物，为后续代谢调控网络解析奠定物质基础。

2.2 4种柳树叶片代谢物的主成分分析（PCA）

采用主成分分析法（PCA）对江达柳、巴郎柳、川滇柳、白柳4种柳树叶片代谢物两两比较进行异质性研究。主成分分析结果显示（图3），所有样本点在PCA图中呈现显著聚集和离散的分布的特征。即某一种柳树的叶片样本点在图中较聚集，而不同种类柳树间样本点位置在主成分PC1维度和主成分PC2维度上均呈现出显著的区分。这种二维空间分异格局空间表明，江达柳、巴郎柳、川滇柳、白柳叶片代谢物每组样本的重复组间存在微小差异，每个重复组间聚类良好且在初级代谢水平上代谢存在一定差异。

2.3 4种柳属叶片代谢物的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）

为进一步分析江达柳、巴郎柳、川滇柳、白柳4种柳树叶代谢物差异，基于主成分分析法（PCA）对4种柳树叶片进行代谢物异质性研究，本研究构建的正交偏最小二乘判别模型（OPLS-DA）与PCA分析形成方法学互证，系统地研究了4种柳树叶片的代谢物差异特征。OPLS-DA结果表明（图4），各组分间聚类良好，且不同柳树间叶片代谢物在坐标轴上有明显的区分，较PCA来讲PLS-DA更进一步说明了这4种柳树叶片的代谢存在差异。

OPLS-DA模型验证见图5，置换检验参数显示，所有R²值均大于0.5且均大于Q²值。说明该统计特征证实模型具有良好稳定性和预测能力，其变量重要性投影（VIP1.0）指标可作为差异代谢物筛选的量化依据，为解析4种柳树叶片遗传代谢提供可靠算法支持，有助于从代谢组学层面揭示江达柳、巴郎柳、川滇柳、白柳对环境适应的分子机制。

2.4 4种柳树叶片差异代谢物筛选

基于正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）构建多维筛选框架，通过多维筛选体系（VIP1.0，P0.05），对江达柳、巴郎柳、川滇柳、白柳4种柳树间差异代谢物进行定量解析，上下调前5的代谢物结果如表2所示，并将差异代谢物进行分类，结果如图6所示。研究发现，江达柳和巴郎柳、江达柳和川滇柳、江达柳和白柳间叶片差异代谢物分别有572个（341个显著上调，231个显著下调）、586个（270个显著上调，316个显著下调）、549个（225个显著上调，324个显著下调）。巴郎柳和川滇柳、巴郎柳和白柳、川滇柳与白柳间差异代谢物分别有586个（210个显著上调，376个显著下调）、602个（185个显著上调，417个显著下调）、532个（255个显著上调，277个显著下调）。

从表2中可以看出，显著上调和显著下调代谢物大豆苷、异槲皮素-3-葡萄糖醛酸酯、槲皮素3-O-（2R-阿比糖基-鼠尾草糖苷）、山柰素等物质均属于黄酮类化合物。从图6可以看出，在6组差异代谢物中黄酮类化合物占比最高，分别为12.48%（71个）、13.18%（77）、15.60%（85个）、14.43%（84个）、13.61%（81个）、16.29%（86个）。黄酮类化合物具有丰富的生物活性，在疾病治疗中极具应用前景^[22,23]，4种柳树叶片差异代谢物筛选结果可为黄酮类药物的开发提供新线索。

2.5 4种柳树代谢物通路分析

对江达柳、巴郎柳、川滇柳、白柳间6组的差异代谢物进行KEGG富集分析，结果如图7所示。不同柳树叶片间的差异代谢物所富集的通路在一级分类水平上主要为细胞过程、环境信息处理、人类疾病、代谢、生物体系统和遗传信息处理。其中，江达柳和巴郎柳间的差异代谢物主要富集的代谢通路是苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、类黄酮生物合成（Flavonoid biosynthesis）、黄酮和黄酮醇的生物合成（Flavone and flavonol biosynthesis）等途径；江达柳和川滇柳间的差异代谢物主要富集的代谢通路是苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、ABC转运蛋白（ABC transporters）、类黄酮生物合成（Flavonoid biosynthesis）等途径；江达柳和白柳间的差异代谢物主要富集的代谢通路是类黄酮生物合成（Flavonoid biosynthesis）、黄酮和黄酮醇的生物合成（Flavone and flavonol biosynthesis）、ABC 转运蛋白（ABC transporters）等途径；巴郎柳和川滇柳间的差异代谢物主要富集的代谢通路是ABC转运蛋白（ABC transporters）、类黄酮生物合成（Flavonoid biosynthesis）、类固醇激素生物合成（Steroid hormone biosynthesis ）等途径；巴郎柳和白柳间的差异代谢物主要富集的代谢通路是类黄酮生物合成（Flavonoid biosynthesis）、黄酮和黄酮醇的生物合成（Flavone and flavonol biosynthesis）、嘌呤代谢（Purine metabolism）等途径；川滇柳和白柳间的差异代谢物主要富集的代谢通路是苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、类黄酮生物合成（Flavonoid biosynthesis）、黄酮和黄酮醇的生物合成（Flavone and flavonol biosynthesis）等途径。以上结果表明，4种柳树叶片间的差异代谢物主要富集在类黄酮生物合成（Flavonoid biosynthesis）、黄酮和黄酮醇的生物合成（Flavone and flavonol biosynthesis）代谢途径上，主要由苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成、ABC转运蛋白、类固醇激素生物合成、嘌呤代谢等途径参与江达柳、巴郎柳、川滇柳、白柳的代谢调控。

3 讨 论

柳树作为一种常见的树种，其根系发达，具有较强的耐旱和耐寒能力、适应力高、生长迅速等优点^[24-26]。已有研究显示，柳树具有广泛的药用潜力，其主要的生物活性成分为黄酮类物质^[7]。LC-MS/MS技术拥有高灵敏度、高分辨率、高特异性和高效分离等特点^[27]，在植物代谢特征和生理研究中已有较多应用。本文采用 LC-MS/MS 技术从江达柳、巴郎柳、川滇柳、白柳4种柳树中共检测3 427个代谢物，主要有苯及取代衍生物、羧酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、香豆素及其衍生物、脂肪酰类化合物、黄酮类化合物、咪唑并嘧啶类、吲哚及其衍生物、异黄酮类、有机氮化合物、有机氧化合物、酚类化合物、异戊烯醇类脂质、甾体及甾体衍生物、苯并吡喃类、吡啶及其衍生物和其他化合物共17类化合物。这与刘墨祥等^[28]对有关柳属植物的化学成分研究所归纳出的结果相似，表明柳属植物的化学成分丰富，可为今后高原其他柳属植物代谢物组成提供参考。

植物代谢物纷繁复杂，在植物中分布的种类，数量上有着非常大的变化和差异^[29]，即使是同属水平下不同物种的植物代谢物也具有显著差异。例如，研究发现不同银杏和珊瑚代谢物谱存在显著差异^[30,31]。通过多维筛选体系进一步从江达柳和巴郎柳、江达柳和川滇柳、江达柳和白柳间筛选叶片差异代谢物。其中，上下调代谢物中异黄酮类、类固醇激素类、甾体类、脂肪酸类、糖苷类数量较多，其中黄酮类化合物占比较高，说明柳属植物普遍含有黄酮类化合物^[32]。黄酮类化合物是一类广泛存在于植物中的天然多酚物质，是植物重要的次生代谢产物，具有抗氧化、抗菌、抗辐射、降血压等生物活性^[33,34]，因此可充分利用柳树叶片发挥此代谢物的药用价值。但是这4种柳树叶片在代谢组层面上，存在本质的、多维度的显著差异。代谢物在种类、数量及相对含量上均存在显著差异，不同柳树间的整体代谢组差异远大于组内个体间的差异，表现出明显的物种特异性代谢特征。仅从4种柳树叶片上下调前5的差异代谢物中也可以发现江达柳和巴郎柳中检测到肽类化合物，江达柳和川滇柳、巴郎柳和川滇柳中检测到呋喃酮类化合物，川滇柳和白柳中检测到生物碱类化合物，且代谢物数量及相对含量均存在显著差异。代谢物差异可能和不同植物的次生代谢物的积累与其遗传基因有关^[35-37]，其中，基因表达与代谢物调控显著相关^[38,39]，说明影响代谢物涵盖成分复杂，非单一因素影响^[40]。而代谢物差异可能导致4种柳树在某些生理功能方面可能也具有差异，例如，从川滇柳和白柳筛中选到三唑醇，可能川滇柳和白柳的抗病毒、抗肿瘤的作用较强^[41]。在江达柳和川滇柳间筛选到羟基孕酮，在江达柳和白柳间筛选到孕酮，这将有可能应用于临床治疗减轻炎症反应^[42]。

KEGG通路富集分析显示，苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成、ABC 转运蛋白代谢通路、类固醇激素生物合成、嘌呤代谢发生显著富集。代谢通路中发现，ABC转运蛋白通路富集到的差异代谢物较多且富集明显，ABC转运蛋白是目前已知的最大也是功能最多的转运蛋白家族之一，ABC转运器相关通路的变化则可能与植物对营养物质的吸收、转运以及次生代谢产物在细胞内的分布与运输有关^[43]。

本研究通过对4种柳树叶片进行非靶向代谢组学分析，初步揭示了种间差异代谢物及其富集的代谢通路。然而，影响样本代谢物差异的其他因素有待于从不同生态环境样本中验证。基于此，未来研究将扩大地理样本量，深入解析柳树次生代谢产物差异与环境互作机制，为柳树的分类学、适应性进化及药用资源开发提供坚实依据。

结 语

本研究采用LC-MS/MS技术，对江达柳、巴郎柳、川滇柳、白柳 4 种柳属植物开展系统性的代谢化合物检测与筛选分析，成功鉴定出3 427个代谢化合物，各类化合物中以黄酮类化合物为主，且代谢物在种类、数量及相对含量上均存在显著差异，明确了这4种柳树的主要代谢物组成特征和种间分布规律。在此基础上，通过 KEGG 代谢通路富集分析进一步探究其代谢调控机制，结果显示，苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成， ABC 转运蛋白、类固醇激素生物合成、嘌呤代谢调控通路，均在这 4 种柳树的代谢生理过程中发挥重要调控作用，共同参与其体内代谢网络的调节与运转。

本研究全面解析了江达柳、巴郎柳、川滇柳、白柳 4 种柳属植物的代谢化合物，并挖掘出参与其代谢调控的关键通路，不仅丰富了高原柳属植物代谢组学的研究数据，也为其资源的多元化综合开发利用提供了重要的物质基础与理论依据，同时也为深入开展高原柳属植物生理生态适应性的分子机制研究、揭示其环境适应的代谢调控策略提供了全新的研究思路与方向。

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基金资助

昆仑英才培养团队项目(0050828)

青海祁连山南坡生态系统定位观察研究站项目(0031212)

青海省科技计划面上项目(0044324)