重组T7噬菌体溶菌酶的纯化及其牙龈卟啉单胞菌溶菌活性研究

摘要

目的 通过基因工程方法获得大肠杆菌（Escherichia coli） T7双链DNA噬菌体溶菌酶（T7 doublestranded DNA bacteriophage lysozyme,T7-Lys），并验证该酶对大肠杆菌及牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）的抗菌活性。方法 根据Gen Bank中的T7-Lys基因序列，并按大肠杆菌的密码子偏向进行优化，人工合成基因，构建p ET-28a（+）/（T7-Lys）原核表达质粒，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中。优化IPTG诱导浓度和大肠杆菌培养温度，通过SDS-PAGE分析可溶性目的蛋白的表达，确定大肠杆菌的最佳培养和诱导条件，通过亲和层析纯化T7-Lys，并评估不同浓度的T7-Lys对大肠杆菌和Pg的溶菌效果。结果 经双酶切和测序鉴定，成功构建了p ET-28a（+）/T7-Lys重组表达质粒。通过Expasy软件的ProtParam工具预测，重组蛋白分子量约为19.15 k Da，亲水性总平均值为-0.565。最佳的IPTG诱导条件为0.5 mmol·L^-1的浓度和23℃的温度，最佳诱导时间为24 h。重组T7-Lys主要以可溶形式表达。实验室规模发酵，结果每升发酵液表达纯化后得到约79.26 mg的T7-Lys蛋白。T7-Lys对大肠杆菌具有溶菌作用，比活为29 081 U·mg^-1，对Pg的溶菌作用更加明显，比活达到35 948 U·mg^-1。结论 成功构建p ET-28a（+）/T7-Lys重组蛋白表达质粒，并获得可溶性T7-Lys重组蛋白。T7-Lys对大肠杆菌和Pg等革兰氏阴性菌均具有显著的溶菌效果。

关键词

牙龈卟啉单胞菌 / 大肠杆菌 / 重组T7溶菌酶 / 诱导表达 / 亲和层析