基于多交叉置换扩增和纳米生物传感技术快速检测肺炎支原体方法的建立

摘要

目的 建立一种简单、灵敏、快速的肺炎支原体(MP)检测方法，并对其应用性进行验证和评价。方法 利用多交叉置换扩增(MCDA)技术对肺炎支原体特异基因CARDS毒素基因进行扩增，利用侧流免疫层析生物传感(LFB)技术读取扩增结果，命名该方法为MP-MCDA-LFB。分析扩增反应在60～67℃(间隔1℃)的扩增效率，筛选最适反应温度；分析分别扩增10、20、30、40 min时能够检测到的最低核酸浓度，筛选最佳反应时间。利用10倍系列稀释的肺炎支原体核酸分析MP-MCDA-LFB方法的灵敏度和检测限，利用35株非肺炎支原体菌株分析MP-MCDA-LFB方法的特异性。利用MP-MCDA-LFB方法检测80份疑似MP感染的临床样本，并与RT-PCR法检测结果进行比较，分析MP-MCDA-LFB方法的临床应用性。结果 MP-MCDA-LFB能够实现对肺炎支原体CARDS毒素基因的快速检测。其最佳反应温度为63℃,最短反应时间为40 min,整个检测过程可在1 h内。MP-MCDA-LFB方法具有较高的灵敏度和特异性，其检测限低至45 ng/L,与其他临床表现相似的病原体无交叉反应，特异性为100%。MP-MCDA-LFB方法从80份临床样本中检出45份阳性样本(56.3%),检出率与RT-PCR方法一致。结论 本研究建立的以CARDS毒素基因为靶标的MP-MCDA-LFB检测方法具有简单、快速、灵敏度高、特异性强的优点，在基层医疗机构和现场检测具有较好的应用潜力。

关键词

肺炎支原体 / 多交叉置换扩增技术 / 侧流免疫层析生物传感技术 / CARDS毒素基因 / RT-PCR