SFRP5去甲基化对β-catenin/NLRP3焦亡介导血管平滑肌细胞钙化的调节机制

摘要

目的 研究分泌型卷曲相关蛋白5(SFRP5)去甲基化对动脉平滑肌细胞钙化的作用及相关机制。方法 体外以高磷刺激人主动脉平滑肌细胞建立钙化模型，设置对照组(正常培养基)、钙化组(高磷3.0 mmol/L)、去甲基化组(高磷+甲基化转移酶抑制剂5-Aza-2dC)和甲基化组(高磷+5-Aza-2dC+过表达甲基化转移酶DNMT1),检测SFRP5启动子甲基化的变化及去甲基化对细胞钙化的作用。首先应用亚硫酸氢盐测序PCR检测SFRP5启动子甲基化位点、甲基化特异性PCR检测甲基化指数，WB法检测SFRP5及甲基化转移酶蛋白表达。通过检测各组细胞外钙含量、茜素红S染色钙结节、成骨转分化指标(BMP-2、RUNX2和ALP)评估细胞钙化改变。再以WB及qPCR检测细胞中的β-catenin、NLRP3及相关焦亡指标(caspase-1 p20、GSDMD-NT),ELISA法测定细胞上清液中焦亡活化指标IL-1β浓度，细胞焦亡特异性PI染色和LDH释放量检测评估细胞焦亡程度。结果 与对照组相比，高磷诱导细胞钙化组中SFRP5的CpG位点甲基化发生率显著升高(37.5%vs 6.9%,P<0.05),其中DNMT1同步表达增加、SFRP5蛋白表达减少(P<0.05),给予去甲基化(5-Aza-2dC)干预后SFRP5甲基化水平下降，DNMT1被抑制、SFRP5蛋白表达恢复(P<0.05)。SFRP5去甲基化后可进一步减轻细胞钙化及成骨转分化，并可抑制β-catenin及NLRP3介导的焦亡通路(P<0.05),过表达DNMT1后上述去甲基化的抑制及保护作用被取消。结论 本研究证实在细胞钙化过程中SFRP5甲基化水平异常升高导致蛋白表达减少，去甲基化后可恢复蛋白表达并减轻钙化，其机制与抑制β-catenin/NLRP3焦亡通路相关，这可能成为临床诊治血管钙化的新靶点。

关键词

血管钙化 / 慢性肾脏病 / 分泌型卷曲相关蛋白5 / 甲基化 / 焦亡

基金资助

北京市自然科学基金资助项目(NO:7244323)