汉防己乙素衍生物LYY-47对三阴性乳腺癌细胞及其多倍体巨瘤细胞增殖、凋亡的作用和机制

摘要

目的 探讨汉防己乙素衍生物LYY-47对三阴性乳腺癌（TNBC）细胞及其多倍体巨瘤细胞（PGCCs）增殖、凋亡的作用和机制。方法 取TNBC MDA-MB-231细胞和MDA-MB-436细胞培养至对数生长期，诱导形成PGCCs,培养35 d,采用苏木素-伊红（H&E）染色观察不同培养时间时2种细胞的PGCCs形态学特征并进行计数；收集MDA-MB-231细胞、PGCCs及其子代细胞，采用流式细胞仪检测分析细胞周期，采用Western blot检测周期相关蛋白[细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）和细胞周期蛋白B1（CyclinB1）]、干性相关蛋白[乙醛脱氢酶1A1（ALDH1A1）、白细胞分化抗原44（CD44）及白细胞分化抗原133（CD133）]、DNA损伤修复相关蛋白[布卢姆（BLM）、Rad51及乳腺癌易感基因1（BRCA1）]及凋亡相关蛋白[BCL2-相关X蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤蛋白-2（Bcl-2）、裂解凋亡蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）及裂解凋亡蛋白酶-8（cleaved Caspase-8）]的表达，采用噻唑蓝（MTT）法和克隆形成实验检测细胞活力和细胞集落数，采用细胞免疫荧光实验检测磷酸化组蛋白2AX（γ-H2AX）的表达；采用荧光偏振实验检测BLM DNA解旋酶的活性；收集对数生长期MDA-MB-231细胞，分为对照组（同等体积的完全培养基）、紫杉醇（PTX）组（500 nmol/L PTX）、3-CF₃, 4-F-苯基类似物（ML216）组（3μmol/L ML216）及ML216+PTX组（500 nmol/L PTX和3μmol/L ML216）,采用Image J软件计数各组细胞数；收集对数生长期MDA-MB-231细胞及其PGCCs子代细胞，分为对照组（0.00μmol/L）、LYY-47给药组（2.50μmol/L、5.00μmol/L及6.50μmol/L）,采用流式细胞仪检测上述各组细胞的凋亡情况；6周龄雌性无特定病原体（SPF）级无胸腺BALB/c裸鼠12只，皮下分别注射5×10～6个MDA-MB-231细胞及其PGCCs子代细胞，每隔3天测量1次肿瘤体积，连续29 d,处死裸鼠剥离肿瘤、称重，取肿瘤组织制作切片，采用H&E染色和免疫组织化学染色观察细胞形态和检测BLM、Ki-67的表达。结果 与TNBC MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞相比，PTX诱导的PGCCs出现增大的细胞核和细胞质区域，通过不对称分裂产生子代细胞；与MDA-MB-231细胞相比，PGCCs中S期和G2/M期细胞增加、CDK1和CyclinB1蛋白表达下调（P<0.05或P<0.01）,其子代细胞中S期细胞增加、G2/M期细胞减少且CDK1、CyclinB1蛋白表达上调（P<0.05或P<0.01）,PGCCs及其子代细胞中ALDH1A1、CD44及CD133蛋白表达上调（P<0.05）,PGCCs子代细胞的增殖和克隆形成能力增强（P<0.05）,γ-H2AX、 BLM、BRCA1及Rad51蛋白表达上调（P<0.05）;与PTX组相比，ML216+PTX组PGCCs形成的数量明显减少（P<0.01）;PGCCs子代细胞体内成瘤的生长速度、肿瘤的体积和重量均大于MDA-MB-231细胞（P<0.01）,瘤体中BLM与Ki-67均呈高表达（P<0.01）;与对照组相比，LYY-47给药组BLM^642-1290DNA解旋酶的ATPase、dsDNA解链活性以及DNA结合活性均下调（P<0.05）, MDA-MB-231细胞及其PGCCs子代细胞中BLM、Rad51及BRCA1蛋白表达也均下调（P<0.05）;与对照组相比，LYY-47给药组和ML216给药组MDA-MB-231及其PGCCs子代细胞增殖和克隆形成能力降低（P<0.05）,LYY-47给药组能够引起MDA-MB-231及其PGCCs子代细胞G2/M期细胞增加（P<0.05）、S期细胞减少（P<0.05）、细胞内周期相关蛋白CDK1与CyclinB1的表达下调（P<0.05）,ML216给药组MDA-MB-231及其PGCCs子代细胞G1期细胞增多、S期细胞减少（P<0.05）;与对照组比较，LYY-47给药组MDA-MB-231细胞及其PGCCs子代细胞的总凋亡比例增加、Bcl-2表达下调及Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8蛋白表达上调（P<0.05）。结论 LYY-47和ML216可影响TNBC及其PGCCs子代细胞的增殖，其机制可能与抑制BLM DNA解旋酶诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期有关。

关键词

乳腺肿瘤 / DNA解旋酶类 / 细胞增殖 / 细胞凋亡 / 汉防己乙素衍生物 / 多倍体巨瘤细胞 / BLM DNA解旋酶