RasGRP1启动子区甲基化对脂多糖诱导人T淋巴细胞炎症的作用及机制

摘要

目的 探讨RAS鸟苷酸释放蛋白1(RasGRP1)启动子区甲基化对脂多糖(LPS)诱导人T淋巴细胞炎症的作用及机制。方法 人T淋巴细胞白血病细胞JurkatE6-1培养至对数生长期，分为对照(完全培养基，C)组、1 mg/L(低浓度)LPS(L1)组、10 mg/L(高浓度)LPS(L2)组及10μmol/L甲基化转移酶抑制剂5-Aza-2′-脱氧胞苷+10 mg/L LPS(LA)组，干预5 d,置于荧光显微镜下观察细胞形态变化；离心收集细胞、留取上清液，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和比色法检测各组细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)浓度及乳酸脱氢酶(LDH)活性，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中RasGRP1、细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2、TNF-α、IL-6、DNA甲基转移酶(DNMT)1、DNMT3a mRNA的表达，采用Western blotting法检测各组细胞RasGRP1、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白的表达，采用甲基化特异性PCR(MSP)法和琼脂糖凝胶电泳检测RasGRP1启动子区甲基化状态。结果 光学显微镜结果显示，C组JurkatE6-1细胞生长状态良好，L1组、L2组细胞数量明显减少，细胞形态趋于碎片化，死亡细胞逐渐增加，随LPS浓度增加而增加；LA组较L2组细胞数量及形态明显好转；与C组比较，L1组JurkatE6-1细胞炎症因子表达升高(P<0.05),细胞RasGRP1、p-ERK1/2表达升高(P<0.05),DNMT1和DNMT3a mRNA表达无差异(P>0.05),RasGRP1启动子区未检测到甲基化表达；与L1组比较，L2组细胞炎症因子表达升高(P<0.05),细胞RasGRP1、p-ERK1/2表达降低(P<0.05),DNMT1和DNMT3a mRNA表达升高(P<0.05),RasGRP1启动子区呈现高甲基化表达；与L2组比较，LA组细胞炎症因子表达降低(P<0.05),细胞RasGRP1、p-ERK1/2表达升高(P<0.05),DNMT1和DNMT3a mRNA表达降低(P<0.05),RasGRP1启动子区未检测到甲基化表达；各组间ERK1/2总量比较无差异(P>0.05)。结论 抑制RasGRP1启动子区高甲基化可减轻LPS诱导的人T淋巴细胞炎症损伤，其机制可能是与调控下游ERK信号通路有关。

关键词

脓毒症 / 脂多糖类 / DNA甲基化 / 炎症 / RAS鸟苷酸释放蛋白1 / JurkatE6-1细胞