丹酚酸B对2型糖尿病小鼠心肌病氧化应激的作用及机制

摘要

目的 探讨丹酚酸B(Sal B)对2型糖尿病小鼠心肌病(DCM)氧化应激的作用及潜在机制。方法 60只C57BL/6J小鼠分为空白组(n=12,Control组，正常饲料，灌胃生理盐水)和高脂高糖(HG)组[n=48,HFG组，链脲佐菌素(STZ)联合HFG饲料构建DCM模型],造模成功的HFG组小鼠分为DCM组(灌胃生理盐水)、Sal B低剂量[1.50 mg/(kg·d)]组(Sal B.L组)、Sal B高剂量[3.00 mg/(kg·d)]组(Sal B.H组)及200 mg/(kg·d)二甲双胍治疗组(Metformin组),灌胃连续8周；麻醉各组小鼠，采用小动物超声仪检测仰卧位时各组小鼠心脏的左室射血分数(LVEF)、缩短分数(FS)、左室收缩末期容积(LVESV)及左室收缩期末期内径(LVIDs);处死各组小鼠，取心脏制作切片、苏木素-伊红(HE)和Masson染色观察心肌组织形态学特征；采用试剂盒检测各组小鼠心肌组织中细胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽(GSH)的水平，采用Western blot分析氧化应激蛋白Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)、核因子-E2相关因子2(Nrf2)、磷酸化Nrf2(pNrf2)、过氧化物酶1(PRDX1)、血红素加氧酶1(HO-1)及凋亡相关蛋白活化的半胱氨酸蛋白(Cleaved-caspase3)、B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl2)、Bcl2关联X(bax)蛋白的表达；SD乳鼠心脏提取分离培养原代新生大鼠心肌细胞(PNRCMs)构建DCM体外模型，将PNRCMs分为40 mmol/L甘露醇(Mannitol)组、空白(Control)组、40 mmol/L HG(HG)组、40 mmol/L HG+25μmol/L Sal B(Sal B低剂量，Sal B.L)组、40 mmol/L HG+50μmol/L Sal B(Sal B高剂量，Sal B.H)组、40 mmol/L HG+0.25 mmol/L二甲双胍(Metformin)组，检测各组细胞的活性氧(ROS)、MDA、SOD及GSH水平，采用Western blot检测氧化应激蛋白Keap1、Nrf2、pNrf2、PRDX1、HO-1及凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3、bax、Bcl2蛋白的表达；采用实时定量反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测氧化应激相关基因Keap1、Nrf2、PRDX1及HO-1信使RNA(mRNA)的表达；采用Nrf2抑制剂(ML385)和激动剂(甲基巴多索隆)进一步分析氧化应激蛋白Keap1、Nrf2、pNrf2、PRDX1及HO-1的表达。结果 与Control组比较，DCM组小鼠的LVEF、FS降低(P<0.01),LVESV、LVIDs升高(P<0.01),心肌组织排列紊乱、间质细胞增多并伴有炎性细胞浸润及胶原沉积，心肌组织中MDA含量增加、SOD和GSH减少(P<0.01),心肌组织中Keap1、Cleaved-caspase3及bax蛋白表达上调，Nrf2、pNrf2、PRDX1、HO-1及Bcl2蛋白表达下调(P<0.01);与Control组比较，HG组心肌细胞中ROS表达增加，SOD表达下降(P<0.05),MDA含量增加、GSH表达下降(P<0.01),心肌细胞中的Keap1、Cleaved-caspase3及bax蛋白表达增加(P<0.01),Nrf2、pNrf2、PRDX1、HO-1及Bcl2蛋白表达下降(P<0.01),心肌细胞中的Keap1 mRNA表达升高(P<0.05),Nrf2、PRDX1及HO-1 mRNA表达降低(P<0.05);与DCM组比，Sal B.L和Sal B.H组小鼠的LVEF、FS增加(P<0.01)、LVESV、LVIDs降低(P<0.01),心肌组织排列整齐、炎性细胞浸润减少、心肌胶原沉积减少，心肌组织中MDA含量减少、SOD和GSH含量增加(P<0.01),心肌组织中Keap1、 Cleaved-caspase3及bax表达下调，Nrf2、pNrf2、PRDX1、HO-1及Bcl2蛋白表达上调(P<0.05);与HG组相比，Sal B.L和Sal B.H量组心肌细胞中ROS表达、MDA含量减少，SOD和GSH含量增加(P<0.05),心肌细胞中的Keap1、Cleaved-caspase3及bax蛋白表达减少(P<0.05),Nrf2、pNrf2、PRDX1、HO-1及Bcl2表达增加(P<0.05);心肌细胞中的Keap1 mRNA表达降低(P<0.05),Nrf2、PRDX1和HO-1 mRNA表达升高(P<0.05);进一步采用Nrf2抑制剂ML385和激动剂甲基巴多索隆干预，与HG组相比，Sal B.H组心肌细胞中的Nrf2、pNrf2、PRDX1及HO-1表达增加(P<0.05);与Sal B.H组相比，ML385和Sal B联用组心肌细胞中的Nrf2、pNrf2、PRDX1及HO-1的表达减少(P<0.05)。结论 Sal B可降低2型糖尿病小鼠DCM的氧化应激作用，其机制与Keap1/Nrf2信号通路蛋白的表达有关。

关键词

糖尿病心肌病 / 氧化性应激 / 细胞凋亡 / 心肌 / 丹酚酸B / 核因子-红细胞-2相关因子2