基于网络药理学的葛根素调节非小细胞肺癌自噬和凋亡相关机制研究

摘要

目的 探究葛根素(PUE)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞自噬和凋亡的调控作用及潜在机制。方法 通过中药系统药理学(TCMSP)等数据库筛选PUE靶标，整合数据库中的NSCLC相关基因，进行目标交集分析，确定共同靶点；构建蛋白质互作网络(PPI),进行基因本体论(GO)功能注释，京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析及分子对接验证；为验证上述预测，取NSCLC细胞株A549和H1299设置对照组、PUE组、雷帕霉素(Rapa)阳性对照组、吉非替尼(EGFRi)组以及EFGRi+PUE组，采用细胞增值毒性试验(CCK-8)与乳酸脱氢酶(LDH)法评估细胞活力，实时定量反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测自噬与凋亡相关基因即自噬相关激酶1(ULK1)、螯合体1(P62)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、B淋巴细胞瘤-2基因(BCL2)、AMP激活的蛋白激酶(AMPK)的表达，蛋白质印迹法(Western blot)检测微管相关蛋白1轻链3β(LC3BⅡ/Ⅰ)、ULK1、P62、LDHA、磷酸化AMP激活的蛋白激酶(P-AmpK)、泛素化半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase3)蛋白的表达，免疫荧光观察自噬相关蛋白P62与LC3B的变化，流式细胞术分析细胞凋亡水平、线粒体膜电位及活性氧(ROS)水平，分析葛根素对表皮生长因子受体(EGFR)、胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及ULK1信号通路蛋白的调控作用。结果 通过网络药理学与分子对接技术筛选出PUE抗NSCLC的9个关键靶基因，确认PUE与EGFR等多个关键靶基因紧密结合；GO与KEGG分析揭示PUE可能通过调控信号转导、凋亡、细胞增殖及PI3K/AKT等通路发挥抗NSCLC作用；体外细胞实验表明，与对照组比较，A549细胞的PUE半数致死浓度(LC50)为0.50 mmol/L(P<0.05),H1299的LC50为1.00 mmol/L(P<0.05);PUE浓度为0.25 mmol/L时，A549和H1299细胞的数量分别下降了57.95%和69.35%(P<0.05);PUE处理诱导A549和H1299细胞，自噬和凋亡基因ULK1、BCL2表达上调，LDHA、AMPK及P62基因表达下调，自噬相关蛋白LC3BⅡ/Ⅰ及ULK1上调，P62、LDHA及EFGR蛋白下调(P<0.05),A549细胞中Cleaved-caspase3表达蛋白上调(P<0.05);流式细胞术显示，PUE处理A549和H1299细胞均能诱导细胞早期凋亡(P<0.05),下调ROS水平和线粒体膜电位水平(P<0.05);免疫荧光显示，PUE处理后增强了A549和H1299细胞LC3B荧光信号，减弱了P62荧光信号(P<0.05);PUE、EFGRi及EFGRi+PUE处理A549和H1299细胞，下调了EGFR、PI3K、AKT、mTOR相关通路基因(P<0.05),及P-EGFR、EGFR、P-PI3K、PI3K、P-AKT、AKT和mTOR等7个关键通路蛋白(P<0.05),且在抑制EGFR后效果增强(P<0.05),证实PUE通过EGFR介导的PI3K/AKT/mTOR/ULK1通路发挥抗NSCLC作用。结论 PUE可能通过EGFR介导了PI3K/AKT/mTOR/ULK1通路，调控NSCLC细胞株A549和H1299的自噬与凋亡，从而发挥抗NSCLC的作用。

关键词

葛根素 / 网络药理学 / 分子对接 / PI3K/AKT/mTOR通路 / 自噬