小鼠Slfn3重组腺病毒载体的构建及其在EPCs中转染效率的测定

摘要

目的 构建携带小鼠Schlafen3 （Slfn3）基因的重组过表达质粒，并观察其在内皮祖细胞（EPCs）中的转染效率。方法 从GenBank基因数据库获取小鼠Slfn3基因序列，利用VectorNTI软件对其进行引物设计，通过PCR扩增获得目的基因，将所得到的目的基因与穿梭载体pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-MCS-3xFLAG相连接，获得重组腺病毒载体pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-Slfn3-3xFLAG;筛选阳性克隆抽提质粒，通过限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切鉴定，并通过DNA测序验证；采用Admax系统将目的穿梭质粒和腺病毒骨架质粒一同转染HEK293细胞获得重组腺病毒（Ad-pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-Slfn3-3xFLAG）,对其进行病毒滴度测定，Western blot验证Slfn3蛋白的表达；体外培养小鼠脾源EPCs 5～7 d,细胞密度达70%后，用Ad-pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-Slfn3-3xFLAG进行转染48 h后，采用荧光显微镜观察并统计绿色荧光细胞数量，计算Ad-pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-Slfn3-3xFLAG转染的效率。结果 DNA测序验证Ad-pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-Slfn3-3xFLAG构建成功，病毒滴度为3.16×10¹⁰（ifu/mL）;腺病毒包装之后的重组腺病毒能够转染HEK293细胞，并在细胞中表达Slfn3-EGFP-3xFLAG融合蛋白，且含有Flag标签的蛋白，大小为57 kDa;重组腺病毒在EPCs中的转染效率为（71.43±2.58）%。结论 成功地构建了小鼠Slfn3的过表达重组腺病毒载体，且在EPCs转染效率较高。

关键词

Schlafen3 / 内皮祖细胞 / 重组腺病毒 / 质粒 / 载体构建 / 基因过表达