心肌缺血再灌注损伤小鼠心肌组织中长链非编码RNA Neat1的表达及其对细胞焦亡的作用机制

摘要

目的 探讨心肌缺血再灌注损伤(MIRI)对小鼠心肌组织中长链非编码RNA Neat1(Lnc Neat1)的表达及细胞焦亡的影响。方法 30只C57BL/6小鼠随机均分为假手术(sham)组[左冠状动脉前降支(LAD)下穿线但不结扎]、缺血/再灌注(I/R)组(结扎LAD),抽取2组小鼠下腔静脉血，麻醉处死后取心脏，采用罗氏全自动生化分析仪检测2组小鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)的活性，采用氯化三苯基四氮唑(TTC)及苏木精-伊红(HE)染色观察2组小鼠心肌组织的心肌梗死面积和组织学特征变化；利用HL-1小鼠心肌细胞构建体外MIRI模型，将HL-1细胞随机分为缺氧4 h组(H4)组和其对照(Control 4 h组)、缺氧4 h复氧1 h(H4R1)组和其对照(Control 5 h)组、缺氧4 h复氧2 h(H4R2)组和其对照(Control 6 h)组、缺氧4 h复氧4 h(H4R4)组和其对照(Control 8 h)组，采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞活力，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞培养上清液中LDH漏出率，采用碘化丙啶(PI)染色观察PI染色阳性率；采用慢病毒感染构建敲低/过表达Lnc Neat1基因，将HL-1细胞随机分为Control组、缺氧4 h复氧4 h组(H4R4)组、敲低Lnc Neat1空载对照组(sh-Lnc Neat1 NC)组、sh-Lnc Neat1 NC+H4R4组、sh-Lnc Neat1组、sh-Lnc Neat1+H4R4组、过表达Lnc Neat1空载对照组(OE-Lnc Neat1 NC)组、OE-Lnc Neat1 NC+H4R4组、OE-Lnc Neat1组及OE-Lnc Neat1+H4R4组，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测Lnc Neat1表达及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、与凋亡相关斑点样蛋白(ASC)信使RNA(mRNA)表达，采用Western blot法检测NLRP3蛋白、ASC蛋白寡聚化及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前体(pro-caspase-1)、cleaved-caspase-1、焦孔素家族蛋白D(GSDMD)、cleaved N-terminal GSDMD、白细胞介素-1β(IL-1β)及IL-18蛋白的表达。结果 与sham组相比，MIRI小鼠血清中LDH、CK-MB活性增加(P<0.05),TTC染色法结果显示I/R组小鼠心肌梗死面积约33%(P<0.05),HE染色法结果显示I/R组缺血区心肌纤维排列紊乱、心肌纤维肌浆肿胀、部分肌浆红染、可见炎性细胞浸润，CCK-8及细胞培养上清液中LDH漏出率检测结果显示缺氧/复氧组HL-1细胞活力以时间依赖性方式降低(P<0.05)、HL-1细胞培养上清液中LDH漏出率增加(P<0.05),PI染色结果显示缺氧/复氧组细胞PI阳性染色率以时间依赖性方式增多(P<0.05);采用慢病毒感染构建敲低/过表达Lnc Neat1基因后，qRT-PCR检测结果显示，与H4R4组对比，sh-Lnc Neat1+H4R4组细胞中NLRP3、ASC mRNA表达下调(P<0.05),OE-Lnc Neat1+H/R组NLRP3、ASC mRNA表达较H4R4组增加(P<0.05);Western blot检测结果显示，与H4R4组对比，sh-Lnc Neat1+H4R4组细胞NLRP3、cleaved-caspase-1、cleaved N-terminal GSDMD、IL-1β及IL-18蛋白表达降低(P<0.05),ASC蛋白寡聚化减少，且OE-Lnc Neat1组+H/R组细胞上述蛋白表达较H/R组增加(P<0.05)、ASC蛋白寡聚化增多。结论 MIRI小鼠心肌组织中Lnc Neat1表达增加，可促进细胞焦亡过程，其机制可能与促进NLRP3和ASC mRNA及蛋白表达、激活NLRP3炎症小体有关。

关键词

心肌缺血 / 再灌注损伤 / 细胞焦亡 / 长链非编码RNA Neat 1 / NLRP3炎症小体 / HL-1小鼠心肌细胞 / 缺氧/复氧