一种盐皮质激素受体抑制剂筛选体系的构建及应用

摘要

目的 建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白标记盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor, MR)的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)稳转细胞株。方法 构建具有嘌呤霉素抗性的pCDH-Puro-CMVR-4×HRE-EGFP重组质粒包被慢病毒，转染NRK-52E细胞，使用puro筛选得到NRK52E-EGFP-MR稳转细胞株；选择MR激动剂醛固酮(aldosterone, Aldo)和抑制剂非奈利酮(finerenone, Fin)干预并观察该细胞的EGFP-MR绿色荧光情况，然后通过Western blot、荧光显微镜观察、流式细胞术、酶标仪荧光定量技术对NRK52E-EGFP-MR细胞进行功能验证，同时选用待测样品M32对NRK52E-EGFP-MR细胞进一步确证。结果 成功构建NRK52E-EGFP-MR稳转细胞株后，在Aldo促进MR的激活状态下，Western blot结果显示NRK52E-EGFP-MR细胞受Aldo干预后，Ⅲ型胶原(typeⅢcollagen, ColⅢ)表达增加，其绿色荧光强度高表达(P<0.05);而加入Fin后ColⅢ表达降低，其绿色荧光强度出现相对下降(P<0.05),并且待测样品M32存在与MR阳性拮抗剂相似的结果，该结果在流式细胞术、多功能酶标仪中也得到确证。结论 该研究所构建的NRK52E-EGFP-MR稳转细胞株这一筛选体系可应用于靶向MR抑制剂或激活剂的筛选，以及受体分子机制的研究。

关键词

盐皮质激素受体 / 醛固酮 / 非奈利酮 / 增强型绿色荧光蛋白标签蛋白 / 细胞荧光