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摘要
目的 建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白标记盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor, MR)的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)稳转细胞株。方法 构建具有嘌呤霉素抗性的pCDH-Puro-CMVR-4×HRE-EGFP重组质粒包被慢病毒,转染NRK-52E细胞,使用puro筛选得到NRK52E-EGFP-MR稳转细胞株;选择MR激动剂醛固酮(aldosterone, Aldo)和抑制剂非奈利酮(finerenone, Fin)干预并观察该细胞的EGFP-MR绿色荧光情况,然后通过Western blot、荧光显微镜观察、流式细胞术、酶标仪荧光定量技术对NRK52E-EGFP-MR细胞进行功能验证,同时选用待测样品M32对NRK52E-EGFP-MR细胞进一步确证。结果 成功构建NRK52E-EGFP-MR稳转细胞株后,在Aldo促进MR的激活状态下,Western blot结果显示NRK52E-EGFP-MR细胞受Aldo干预后,Ⅲ型胶原(typeⅢcollagen, ColⅢ)表达增加,其绿色荧光强度高表达(P<0.05);而加入Fin后ColⅢ表达降低,其绿色荧光强度出现相对下降(P<0.05),并且待测样品M32存在与MR阳性拮抗剂相似的结果,该结果在流式细胞术、多功能酶标仪中也得到确证。结论 该研究所构建的NRK52E-EGFP-MR稳转细胞株这一筛选体系可应用于靶向MR抑制剂或激活剂的筛选,以及受体分子机制的研究。
关键词
盐皮质激素受体
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醛固酮
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非奈利酮
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增强型绿色荧光蛋白标签蛋白
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细胞荧光
Key words
一种盐皮质激素受体抑制剂筛选体系的构建及应用[J].
贵州医科大学学报, 2025, 50(04): 480-489+528 DOI:10.19367/j.cnki.2096-8388.2025.04.002