YTHDF3对去势抵抗性前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的作用及机制

摘要

目的 探讨N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)甲基化结合蛋白YTH域家族蛋白3(YTH domain family protein 3, YTHDF3)调控细胞周期蛋白依赖性激酶7(cyclin-dependent kinase 7, CDK7)表达对去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer, CRPC)细胞增殖及迁移、侵袭的影响及其机制。方法 取对数生长期RWPE-1和DU145细胞，采用Western blot法检测2种细胞中YTHDF3蛋白的表达；取对数生长期DU145细胞，采用携带YTHDF3 shRNA的慢病毒构建沉默YTHDF3稳转细胞株(沉默YTHDF3组),相应的对照慢病毒构建对照细胞(对照组),采用CDK7 siRNA转染DU145细胞构建沉默CDK7组细胞株(沉默CDK7组),相应的对照构建对照细胞(对照组),采用CCK-8实验检测各组DU145细胞培养24、48及72 h时波长450 nm处的吸光度值；采用EdU增殖实验和Transwell实验检测各组DU145细胞增殖能力和迁移、侵袭能力；使用实时定量聚合酶链式反应(qPCR)检测各组DU145细胞中YTHDF3和CDK7 mRNA表达；采用流式细胞术检测各组DU145细胞的细胞周期；使用GEPIA分析正常前列腺组织和前列腺癌(prostate cancer, PCa)组织中CDK7的表达及PCa组织中YTHDF3和CDK7表达的相关性，使用human protein atlas (HPA)数据库中调取CDK7蛋白在正常前列腺组织和PCa组织中的表达，使用Kaplan-Meier Plotter制作CDK7表达高PCa患者和CDK7表达低PCa患者的生存曲线，使用SRAMP预测CDK7 mRNA序列上的潜在m6A位点；使用放线菌素D分别处理对照组和沉默YTHDF3组DU145细胞0、3、6及9 h,采用qPCR方法检测CDK7 mRNA的稳定性。结果 DU145细胞中YTHDF3的表达明显高于正常前列腺RWPE-1细胞(P<0.001);与对照组相比，沉默YTHDF3组DU145细胞中YTHDF3蛋白、CDK7蛋白及CDK mRNA的表达水平下降(P<0.001),细胞周期S期占比下降(P<0.001);与对照组相比较，沉默YTHDF3和CDK7组DU145细胞活力、增殖、迁移和侵袭能力下降(P<0.05);生物信息学分析和免疫组织化学结果显示，PCa组织中CDK7蛋白较正常前列腺组织高表达，SRAMP网站预测CDK7 mRNA有7个潜在m6A位点；与对照组相比，沉默YTHDF3组DU145细胞CDK7 mRNA的相对表达水平下降(P<0.05)。结论 YTHDF3可促进CRPC细胞的增殖、迁移及侵袭能力，其机制与调控CDK7 mRNA的稳定性有关。

关键词

前列腺肿瘤 / 细胞增殖 / 细胞迁移分析 / YTH结构域的家族蛋白3 / 细胞周期蛋白依赖性激酶7

基金资助

国家自然科学基金项目(31960137、32260171)