p53S通过DREAM/MMB通路调控Werner综合征细胞端粒DNA复制及延伸

摘要

目的 研究抑癌基因TP53(tumor protein 53, TP53)突变后编码的蛋白(p53N236S, p53S)通过下游调节元件拮抗调节剂/髓细胞组织增生病毒癌基因同源物-多细胞B类复合物(DP, RB-like, E2F, and MuvB complex/Myb-MuvB complex, DREAM/MMB)通路对Werner综合征(werner syndrome, WS)细胞端粒DNA复制的调控作用及其机制。方法 以引入p53S突变的第五代WS小鼠胚胎成纤维细胞(G5TM)为研究对象，以野生型(WT)、第五代WS小鼠(G5DM)及敲除p53的第五代WS小鼠(G5TKO)胚胎成纤维细胞为对照，蛋白印记法(Western blot)检测各组细胞中DREAM/MMB相关蛋白和细胞周期相关蛋白的表达，染色质免疫沉淀法(Co-IP)检测各组细胞中DREAM/MMB通路调控关键蛋白与其相互作用蛋白的结合；染色质免疫沉淀法(ChIP)检测三种基因型细胞中(WT、G5DM、G5TM)p53与DAERM/MMB通路基因启动子的结合情况，免疫荧光-荧光原位杂交技术法(immunofluorescence-fluorescence in situ hybridization, IF-FISH)检测各组细胞中DNA解旋酶和端粒保护蛋白以及DNA损伤标志蛋白同端粒信号的共定位情况，端粒DNA实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)检测各组细胞端粒的相对长度。结果 Western blot结果表明，在G5TM细胞中p53S蛋白表达显著上调，下游靶基因p21在G5TM及G5KO细胞中表达被抑制(P<0.05);通过对比WT、G5DM及G5TKO细胞，发现p53S特异性激活DREAM/MMB复合体通路，关键组分B-Myb、FoxM1、p130、p-Rb、Lin54、Lin9和E2f1的表达均被上调(P<0.05);Co-IP实验揭示，p53S通过增强Lin9与p130及B-Myb的相互作用，促进DREAM/MMB复合体的功能重构；ChIP分析证实，p53能直接结合Lin54、Lin9、Mybl2和Rbl2的启动子区域，其结合强度高于WT及G5DM,提示其通过转录调控激活这些基因(P<0.05),同时p53S上调Cdc25c及CDK1/2/4/6等蛋白的表达，协同推动细胞周期进程(P<0.05);IF-FISH结果显示，p53S促进Recql4、Blm、Terf1和Pot1a与端粒DNA的共定位，并增强端粒信号强度(P<0.05),而G5DM及G5TKO细胞中ATR在端粒区异常聚集，表明p53S通过招募保护因子维持端粒完整性；端粒qPCR证实p53S可恢复端粒复制能力(P<0.05),提示其通过激活增殖通路与端粒保护机制协同促进细胞端粒的延伸。结论 p53S的引入可以上调DNA解旋酶、端粒保护蛋白并招募到端粒DNA,缓解WS所造成的端粒复制压力，有利于端粒的延伸。

关键词

Werner综合征 / p53S突变 / DREAM/MMB / DNA解旋酶 / 端粒