Aβ寡聚体改变HRP酶催化TMB底物反应的初步研究

摘要

目的 探讨建立β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Aβ)寡聚体和十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)改变辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB)底物显色反应的方法，并验证酶活性的改变。方法 采用HRP标记的免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)建立HRP酶活性的检测方法，设计并筛选最佳实验条件研究Aβ寡聚体和SDS对HRP酶活性的影响，采用HRP蛋白进一步验证Aβ寡聚体对HRP酶活性的影响，通过Western blot和非变性凝胶电泳鉴定不同的Aβ聚集体，并验证不同的Aβ聚集体影响HRP酶催化TMB底物显色反应的强弱。结果 HRP标记的IgG最佳工作浓度为1∶100 000倍稀释；随孵育时间的延长HRP酶活性降低(P<0.05);将Aβ与HRP工作溶液直接混合后在37℃下孵育12 h为检测Aβ寡聚体影响HRP酶活性的最佳条件；HRP蛋白的最佳工作浓度为10～100μg/L;随着SDS浓度的增加，HRP酶催化TMB底物显色反应活性逐渐降低，而Aβ寡聚体浓度的增加则增加HRP酶活性(P<0.05);区别于Aβ单体，Aβ寡聚体在40 kDa处有较大聚集体，Aβ纤维在大于180 kDa处有更大的聚集体；和Aβ单体和纤维相比，6.25 mg/L的Aβ寡聚体对HRP酶活性的影响更强(P<0.05);和Aβ单体和寡聚体相比，100 mg/L的Aβ纤维对HRP酶活性的影响更强(P<0.05)。结论 本研究成功建立一种检测Aβ寡聚体对HRP酶活性影响的方法，并证实Aβ寡聚体与SDS改变HRP酶催化TMB底物显色反应，其中，低浓度Aβ寡聚体和高浓度Aβ纤维对HRP酶活性的影响更为显著。

关键词

β-淀粉样蛋白 / Aβ寡聚体 / 十二烷基硫酸钠 / HRP酶 / 酶活性