褪黑素通过靶向YTHDF3表达抑制去势抵抗性前列腺癌的迁移和侵袭

摘要

目的 探讨褪黑素调控N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)甲基化结合蛋白YTH域家族蛋白3(YTH domain family protein 3, YTHDF3)表达，对去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer, CRPC)细胞增殖、迁移和侵袭以及对小鼠皮下成瘤生长的影响及其机制。方法 人CRPC组织及其对应的癌旁组织通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测YTHDF3蛋白的表达，小分子对接技术预测褪黑素与YTHDF3的结合能，CCK-8法检测褪黑素处理后的CRPC细胞活力；5-乙炔-2′-脱氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine, EdU)增殖实验和Transwell实验检测褪黑素处理48 h后各组DU145和PC3细胞的增殖能力、迁移和侵袭能力；Western blot检测沉默YTHDF3后YTHDF3及其靶基因波形蛋白(Vimentin)的蛋白表达情况，Western blot检测褪黑素处理CRPC细胞48 h后YTHDF3及其靶基因Vimentin的表达水平，放线菌素D处理对照组和沉默YTHDF3组的CRPC细胞；实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)检测Vimentin信使RNA(messenger RNA, mRNA)的稳定性，m6A修饰位点数据库(sequence-based RNA adenosine methylation site predictor, SRAMP)预测Vimentin mRNA序列上的潜在m6A位点，RNA免疫沉淀-定量聚合酶链反应(RNA immunoprecipitation-qPCR,RIP-qPCR)检测YTHDF3与Vimentin mRNA的m6A修饰位点结合情况，褪黑素处理分别转染YTHDF3野生型(YTH domain family protein 3-wild type, YTHDF3-WT)或YTHDF3野生型(YTH domain family protein 3-mutant, YTHDF3-Mut)的VCaP细胞；Western blot检测YTHDF3表达，裸鼠皮下注射成瘤检测褪黑素治疗对于肿瘤生长的影响。结果 Western blot结果显示，CRPC组织中的YTHDF3表达高于癌旁组织(P<0.05);褪黑素可与YTHDF3的m6A芳香族笼结合，结合能为-38.96 kJ/mol;与对照组相比，褪黑素处理抑制了CRPC细胞的活力、增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05),并抑制了小鼠肿瘤的生长(P<0.01);Western blot结果表明，YTHDF3在CRPC细胞中促进Vimentin的蛋白表达(P<0.05);RNA稳定性实验结果表明与对照组相比，沉默YTHDF3后Vimentin mRNA稳定性降低(P<0.05);SRAMP预测Vimentin mRNA序列上具有10个潜在m6A位点；RIP-qPCR实验结果表明，YTHDF3与Vimentin mRNA中的m6A位点1、2、3/4和7/8/9/10结合(P<0.001);Western blot结果进一步证实，褪黑素能够阻断YTHDF3与识别并结合m6A,从而抑制YTHDF3的表达(P<0.05)。结论 褪黑素通过竞争YTHDF3与其m6A的结合位点，抑制YTHDF3及其靶基因Vimentin的表达，进而抑制CRPC细胞的活力、增殖、迁移和侵袭，并抑制肿瘤生长。

关键词

前列腺肿瘤 / m6A RNA甲基化 / YTHDF3 / 褪黑素 / 细胞迁移 / 细胞侵袭