组蛋白H3K4me3促进NEAT1表达介导小鼠心肌缺血再灌注损伤中细胞铁死亡的作用

摘要

目的 探索在心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI）中组蛋白3赖氨酸4三甲基化（trimethylation of lysine 4 on histone H3,H3K4me3）促进长链非编码RNA核富集转录本1（nuclear enriched abundant transcript 1,NEAT1）表达介导铁死亡的作用及机制。方法 16只C57BL/6小鼠随机分为假手术组（sham）组和缺血/再灌注（I/R）组，采用氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride, TTC）及苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色观察小鼠心肌梗死和病理结构变化；用H/R条件培养HL-1心肌细胞的方法复制体外MIRI模型，选择缺氧4 h（H4）及复氧1 h（H4/R1）、2 h（H4/R2）、4 h（H4/R4）时间点进行观察，用cell counting kit-8（CCK-8）法检测细胞活力，DCFH-DA探针检测细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）,比色法分别检测丙二醛（malondialdehyde, MDA）、谷胱甘肽（glutathione, GSH）和铁离子水平，用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测心肌组织和细胞谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）、长链酰基辅酶A合成酶4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4）、转铁受体蛋白1（transferrin receptor 1,TfR1）、赖氨酸甲基转移酶2A（lysine methyltransferase 2A,KMT2A）、赖氨酸特异性组蛋白去甲基酶1A（lysine-specific demethylase 1A,KDM1A）等蛋白质表达水平及H3K4me3水平，qRT-PCR法检测心肌组织和细胞NEAT1表达水平；用慢病毒载体稳定转染细胞敲低NEAT1后进行H4/R4处理，观察细胞铁死亡各项指标变化；再用特异性KMT2A抑制剂MM-102（50μmol/L）预处理细胞2 h,或用慢病毒载体稳定转染细胞敲低KMT2A或过表达KDM1A后进行H4/R4处理，观察H3K4me3和NEAT1表达水平变化。结果 与sham组相比，I/R组小鼠心肌梗死面积约41%,心肌组织GPX4蛋白水平降低，ACSL4和TfR1蛋白水平增加，NEAT1表达水平升高，H3K4me3和KMT2A蛋白水平增加，KDM1A蛋白水平降低（P<0.05）;与Control组相比，缺氧后随着复氧时间延长，细胞活力下降，ROS、MDA、Fe³⁺和Fe²⁺水平均升高，GSH含量降低，GPX4蛋白水平降低，ACSL4和TfR1蛋白水平增加，NEAT1表达水平增加，H3K4me3和KMT2A蛋白水平增加，KDM1A蛋白水平降低（P<0.05）;与敲低NEAT1 NC组相比，敲低NEAT1+H4/R4组ROS、MDA、Fe³⁺和Fe²⁺均降低，GSH升高，GPX4蛋白表达升高，ACSL4和TfR1蛋白表达下降（P<0.05）;与H4/R4组相比，MM-102+H4/R4组H3K4me3水平和NEAT1表达水平均降低（P<0.05）;与敲低KMT2A Vector+H4/R4组相比，敲低KMT2A+H4/R4组H3K4me3和NEAT1表达水平降低（P<0.05）;与过表达KDM1A Vector+H4/R4组相比，过表达KDM1A+H4/R4组H3K4me3和NEAT1表达水平降低（P<0.05）。结论 MIRI诱导NEAT1表达上调可介导心肌细胞铁死亡，NEAT1表达上调可能是KMT2A表达增多和KDM1A表达减少导致NEAT1基因H3K4me3修饰水平增高引起的。

关键词

心肌缺血再灌注损伤 / 长链非编码RNA核富集转录本1 / 铁死亡 / 心肌细胞 / 组蛋白甲基化