YTHDF3稳定沉默MCF-7和MDA-MB-231细胞株构建及筛选

摘要

目的 构建YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白3(YTH N6-methyladenosine RNA binding protein F3,YTHDF3)稳定沉默的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞株。方法 数据库分析YTHDF3在乳腺癌中的表达及其与预后的相关性，选定蛋白研究靶点；利用人肾上皮细胞293T细胞产生含有YTHDF3-短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒颗粒，转染MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞系，并利用嘌呤霉素筛选不含嘌呤抗性的阴性细胞，构建YTHDF3稳定沉默的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞株；将MCF-7和MDA-MB-231细胞分为阴性对照组(shNC组，转染无意义序列)、shY3-1组(转染沉默YTHDF3的第一条shRNA)及shY3-2组(转染沉默YTHDF3的第二条shRNA);实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)检测YTHDF3 mRNA表达，Western blot检测YTHDF3蛋白沉默效率。结果 YTHDF3在乳腺癌不同内在分子亚型中高表达，且其高表达与不良预后显著相关；经嘌呤霉素筛选后，成功获得sh-NC组、shY3-1组和shY3-2组稳定转染的MCF-7和MDA-MB-231细胞系；与sh-NC组相比，shY3-1组和shY3-2组细胞的YTHDF3蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论 初步构建了YTHDF3稳定沉默的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞株。

关键词

乳腺肿瘤 / 慢病毒 / RNA干扰 / YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白3 / m6A修饰