蜗牛黏液提取物糖胺聚糖在角膜上皮损伤中的作用

摘要

目的 探讨白玉蜗牛黏液提取的白玉蜗牛糖胺聚糖(achatina fulica glycosaminoglycan, AFG)在角膜上皮损伤愈合过程中的作用及其机制。方法 人角膜上皮细胞(human corneal epithelial cell, HCE)中加入不同浓度的AFG,24 h后用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)测定细胞增殖及检测药物毒副性，确定AFG促HCE生长且无毒的最适浓度，用最适AFG浓度做细胞划痕实验观察其对HCE增殖及迁移的影响；在显微镜下用电动角膜上皮刮刀刮除40只C57/BL6小鼠右眼角膜中央直径约2.5 mm的上皮，构建角膜上皮损伤模型，然后随机分为不给予处理的模型组(模型组)、磷酸盐缓冲液载药组(PBS组)、表皮生长因子(重组人表皮生长因子滴眼液10 000 IU,20 mg/L)阳性对照组(EGF组)以及0.2 g/L AFG治疗组(AFG组),共4组(n=10),各组给予相应药物滴眼，4次/d,持续2 d,第0、12、24、36、48 h分别进行角膜荧光染色显微镜下拍照记录；于损伤2 d后取小鼠角膜，行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察角膜形态；提取总RNA和蛋白，实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)和免疫印迹(western blot)检测各组角膜组织的白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、角蛋白12(keratin 12,K12)、ATP结合盒转运蛋白G2(ATP-binding cassette subfamily G member 2,ABCG2)、增殖细胞核抗原KI67(antigen Ki-67,KI67)、肿瘤蛋白P63(tumor protein p63,P63)、配对盒基因6(paired box gene 6,PAX6)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)以及小脯氨酸丰富蛋白1B(small proline-rich protein 1B,SPRR1B)等mRNA或蛋白的表达。结果 AFG促HCE生长且无毒的最适浓度为0.05 g/L,最适浓度AFG处理HCE细胞后，处理组的HCE细胞增殖速度比空白对照组快，AFG组K14、KI67、P63 mRNA表达升高(P<0.05);在小鼠角膜损伤愈合过程中，与模型组比，AFG组角膜愈合速度更快、上皮生长更好；AFG组K12、ABCG2、Ki67、PAX6、P63 mRNA表达升高(P<0.05),SPRR1B、TNF-α、IL-6 mRNA表达降低(P<0.05);AFG组K12、PAX6、SOD2蛋白表达升高。结论 AFG可促进角膜上皮细胞再生，加快角膜损伤愈合速度，其机制可能与抑制炎症反应、促进角膜上皮干细胞增殖有关。

关键词

角膜上皮损伤 / 炎症 / 角膜缘上皮干细胞 / 蜗牛黏液提取物 / 白玉蜗牛糖胺聚糖