MEN1调控半胱氨酸代谢抑制肺癌生长的机制

摘要

目的 探讨多发性内分泌肿瘤1型综合征（multiple endocrine neoplasia type 1, MEN1）关键基因MEN1调控半胱氨酸代谢在肺癌发展中的作用及机制。方法 18只C57BL/6小鼠包含WT组（野生型作为对照组，n=6）,KMS组[肺泡Ⅱ型上皮细胞（typeⅡalveolar epithelial cells, AT2）特异性Men1敲除联合鼠类肉瘤病毒癌基因G12D位点(kirsten rat sarcoma viral oncogene ^G12D, Kras^G12D),n=6]和KS组(AT2细胞Kras^G12D突变诱导，n=6);12只C57BL/6小鼠包含Men1-WT组（野生型作为对照组，n=6）和CKO组（Men1条件性敲除，n=6）;NCI-H460细胞分为NC组（MEN1野生型）和KO组（MEN1敲除）;A549细胞分为shLuc组（感染shLuc慢病毒）、shMEN1组（MEN1敲低）、vector组（感染vector慢病毒）和oeMEN1组（MEN1过表达）;收集5位肺癌患者的肿瘤和癌旁组织，按各分期分为肿瘤组和癌旁组；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin staining, HE）染色检测小鼠肿瘤发生情况；免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）检测KS和KMS小鼠肺组织中胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-beta-synthase, CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine gamma-lyase, CTH）蛋白表达；克隆形成检测半胱氨酸和MEN1对细胞增殖能力影响；流式细胞仪检测半胱氨酸和MEN1对肺癌细胞死亡影响；通过对硫化氢（hydrogen sulfide, H₂S）产生量检测验证肺癌和MEN1对半胱氨酸合成代谢的影响；实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR）和Western blot检测MEN1敲除和半胱氨酸缺乏对CBS、CTH、溶质载体家族3成员2（solute carrier family 3 member 2,SLC3A2）及溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11,SLC7A11）的mRNA和蛋白表达影响；染色质免疫共沉淀-实时荧光定量PCR（chromatin immunoprecipitation quantitative polymerase chain reaction, ChIP-qPCR）检测menin和组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化（histone H3 lysine 4 trimethylation, H3K4me3）与CBS和CTH启动子区域结合。结果 MEN1缺失促进肺癌细胞增殖和克隆形成（P<0.05）,加速Kras^G12D诱导肺癌小鼠的发病进程；半胱氨酸缺乏条件，MEN1缺失减少NCI-H460细胞死亡（P<0.01）;MEN1缺失降低肺癌细胞中半胱氨酸水平（P<0.05）,抑制转硫途径相关基因CBS和CTH的mRNA和蛋白表达（P<0.01）,MEN1过表达促进CBS和CTH蛋白表达；人肺癌组织与癌旁组相比menin、CBS和CTH蛋白均低表达（P<0.05）。ChIP-qPCR结果显示menin和H3K4me3在CBS和CTH启动子高度富集，MEN1敲除显著降低CBS和CTH启动子区域H3K4me3的修饰水平（P<0.01）。结论 MEN1是一个重要的肺癌抑制因子，通过H3K4me3激活CBS和CTH的转录，调控半胱氨酸代谢，从而抑制肺癌的发展。

关键词

肺肿瘤 / MEN1基因 / 半胱氨酸代谢 / menin蛋白 / H3K4三甲基化修饰