荧光PCR溶解曲线法检测480株结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药情况及其临床应用

摘要

目的 分析480株结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)对吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)耐药情况，评估荧光PCR溶解曲线法检测MTB对PZA耐药性的效能。方法 收集2023年8月—2024年8月送贵阳市公共卫生救治中心结核病(tuberculosis, TB)实验室检测的480株MTB复合群菌株，表型药物敏感性(以下简称表型药敏)试验检测其对一线抗TB药物的耐药性；以该表型药敏结果为参照标准，采用荧光PCR溶解曲线分析(PCR melting curve analysis, PCR-MCA)评估480株MTB对PZA的耐药性，并分析其在耐药性判断中的敏感性与特异性，使用Kappa一致性检验比较两种检测方法的一致性程度，对两种检测方法结果不一致菌株进行基因测序验证。结果 480株MTB中，一线抗TB药物耐药率排序为异烟肼(isoniazid, INH)>利福平(rifampicin, RFP)>链霉素(streptomycin, SM)>PZA>乙胺丁醇(ethambutol, EMB);两种检测方法在不同耐药级别(0～4种)MTB菌株中获得的PZA耐药结果相一致，均随着耐药级别增加而升高(P<0.05);荧光PCR-MCA法与表型药敏试验结果总体符合率达94.79%(455/480),灵敏度为67.14%,特异度99.51%,诊断效能指标Kappa为0.761,AUC为0.833;在耐多药MTB菌株中，荧光PCR-MCA法检测性能可靠，灵敏度、特异度及总符合率分别达85.71%、100%和91.36%,Kappa为0.826,AUC为0.929;25株结果不一致菌株基因测序验证结果显示，23株基因测序表型耐药/分子敏感的样本中，5株未发现PZA耐药相关基因突变，18株存在耐药相关突变位点，包括pncA、Rv1258c、rpsA、panD、clpC1及PPE35等基因突变，另外2株为表型药敏敏感/分子耐药，基因测序未检测到PZA相关耐药基因突变。结论 荧光PCR-MCA法对PZA耐药具有较好检测效能，有助于早期、快速筛查MTB的PZA耐药情况。

关键词

结核分枝杆菌 / 吡嗪酰胺 / 耐药结核病 / 荧光PCR溶解曲线法 / 一线抗结核药物