细胞色素P450酶2C19代谢活化介导异补骨脂素的细胞毒性机制

摘要

目的 通过构建稳定表达细胞色素P450酶（CYP）2C19的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系，探讨异补骨脂素的肝毒性机制。方法 使用Lipofectamine^TM2000和pcDNA5/FRT-CYP2C19质粒构建CYP2C19-CHO细胞系，将细胞分为Flp-InTM CHO组、Vehicle-CHO组和CYP2C19-CHO组；通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western blot、荧光素酶实验分别检测转染细胞中CYP2C19的表达及酶活性；采用不同浓度异补骨脂素（0～100μmol/L）处理CYP2C19-CHO细胞及小鼠肝原代细胞，其中小鼠肝原代细胞另设对应浓度异补骨脂素+噻氯匹定（10μmol/L）组，使用MTS细胞增殖检测试剂盒（MTS）和流式细胞术检测细胞毒性和凋亡，Western blot检测细胞中B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和切割后的半胱天冬酶-3（Cleaved Caspase-3）蛋白表达水平。结果 与Vehicle-CHO组相比，CYP2C19-CHO组细胞中CYP2C19的mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.001）,酶活性明显增加（P<0.001）,表明CYP2C19-CHO转基因细胞构建成功；异补骨脂素处理后，与Vehicle-CHO相比，CYP2C19-CHO细胞存活率明显降低（P<0.001）,细胞凋亡率明显增加（P<0.001）,Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达明显增加（P<0.001）、Bcl-2蛋白表达明显降低（P<0.001）;异补骨脂素可明显诱导小鼠肝原代细胞凋亡（P<0.001）,而噻氯匹定+异补骨脂素组可明显拮抗该作用。结论 成功构建了稳定表达CYP2C19的Flp-In^TM CHO细胞系，且异补骨脂素可能被CYP2C19代谢活化从而诱导细胞凋亡，导致肝毒性。

关键词

细胞色素P450酶2C19 / Flp-In^TM CHO细胞系 / 异补骨脂素 / 代谢活化 / 细胞凋亡

基金资助

国家自然科学基金项目(82360817); 贵州省基础研究计划项目[自然科学(ZK[2022]重点037)]; 贵州省卫生健康高质量发展医学科研联合基金项目(2024GZYXKYJJXM0133); 贵州省科技计划项目(黔科合中引地[2023]006); 贵州省科技重大专项项目(黔科合重大专项字[2024]015); 贵州省现代中药创制全省重点实验室(黔科合平台ZSYS [2025]019)