Pink1通过调控Drp1参与高氨诱导线粒体异常分裂的机制研究

摘要

目的 阐明线粒体自噬相关蛋白Pink1在高氨诱导线粒体碎片化中的作用及分子机制。方法 体外培养人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞，给予不同浓度NH₄Cl分别处理24、48 h后，利用CCK-8评估细胞活性，结合Hoechst法检测细胞凋亡；选取合适NH₄Cl浓度，观察线粒体自噬相关蛋白Pink1在蛋白水平表达变化；随后给予Pink1干扰的慢病毒处理，使用透射电子显微镜（TEM）、免疫荧光、Western blotting以及线粒体ATP检测等方法评估Pink1敲除(Pink1^KD)对线粒体动力相关蛋白Drp1、线粒体数量、密度及ATP合成功能的影响。结果 随着氨浓度升高和作用时间延长，细胞活性显著降低（P<0.01）,5.0 mmol/L NH₄Cl处理24 h细胞即已出现凋亡现象，因此，5.0 mmol/L NH₄Cl处理24 h为细胞活性未降低的最大剂量；氨刺激细胞内线粒体相关自噬蛋白比例Pink1/Parkin表达显著升高（P<0.05,P<0.01）;Western blotting和免疫荧光染色结果显示Pink1^KD可减少氨诱导的Drp1表达增加（P<0.05）;TEM显示Pink1^KD可降低氨诱导的线粒体密度增加（P<0.05）,而对线粒体覆盖率以及线粒体平均面积无明显影响；检查线粒体ATP合成功能显示Pink1^KD可改善线粒体ATP合成功能（P<0.01）。结论 靶向敲除线粒体Pink1可通过减少Drp1表达而缓解高氨诱导的线粒体碎片化，进而恢复线粒体ATP合成功能。本研究为高氨诱导线粒体形态异常和功能障碍提供了分子机制和潜在治疗靶点。

关键词

高氨 / 线粒体 / Pink1 / Drp1 / ATP

基金资助

国家自然科学基金(82000551,81870415); 河南省医学科技攻关计划联合共建项目(LHGJ20210804)