酿酒酵母工业菌株中Ⅱ型启动子介导sgRNA表达的CRISPR/Cas9基因编辑系统的优化

摘要

CRISPR(clustered regulatory interspersed short palindromic repeat)系统因其高效、无痕、简便等特点已被广泛应用于生物基因编辑研究领域。就微生物基因编辑而言，该系统的研究主要集中于单倍体细胞的基因编辑操作。然而，对于遗传背景更为复杂的多倍体细胞来说，高效基因编辑系统的匮乏是制约工业菌株遗传改造及应用的关键因素。因此，以酿酒酵母二倍体工业菌株为研究对象，构建并系统优化了RNA PolⅡ(PolⅡ)和RNA PolⅢ(PolⅢ)两种启动子驱动sgRNA表达的CRISPR/Cas9基因编辑体系，同时对转化条件进行优化提高多位点基因编辑效率。研究结果表明，PolⅡ启动子可实现3对等位基因(即6个基因)一次性敲除，效率高达68%。随后也对目标基因多位点敲入进行了初步探索。该研究建立的酿酒酵母工业菌株CRISPR/Cas9基因编辑系统为菌株快速遗传改造提供强有力的技术支撑。

关键词

二倍体工业酵母 / CRISPR/Cas9 / RNA PolⅡ / RNA PolⅢ / 基因编辑