益肾喘宁汤调控哮喘细胞自噬、凋亡及焦亡机制研究

摘要

目的 研究益肾喘宁汤调控脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的人支气管气道上皮样细胞（human bronchial epithelial cells,16HBE）自噬及相关机制。方法 实验分为5组：正常组、模型组、中药组、地塞米松组、中药+地塞米松组。采用细胞计数试剂盒-8法（cell counting kit-8 assay,CCK-8）检测细胞增殖活力，筛选益肾喘宁汤最佳剂量；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）释放法观察细胞受损状况；透射电镜观察自噬小体的形态变化；自噬双标腺病毒实验检测自噬流；TUNEL染色观察细胞凋亡率；免疫荧光检测胱天蛋白酶-1(cysteine-dependent aspartate-specific protease-1,Caspase-1)的表达；Western blot检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)、Caspase-1、胱天蛋白酶-3(cysteine-dependent aspartate-specific protease-3,Caspase-3)、Beclin-1、自噬相关蛋白5(autophagy-related protein 5,Atg-5)的表达水平。结果 CCK-8实验结果显示，益肾喘宁汤冻干粉浓度为20%、培养48 h时效果最佳。透射电镜观察，正常组细胞形态正常，细胞膜完整，线粒体嵴结构清晰，自噬体数量较多；模型组线粒体形态正常，自噬体较少；中药组线粒体皱缩，嵴结构减少，膜密度增加，自噬体数量较模型组增多；地塞米松组线粒体肿胀，嵴结构减少，自噬体数量与中药组相似；中药+地塞米松组线粒体肿胀，嵴结构减少，自噬体数量较中药组进一步减少。自噬双标腺病毒实验显示，模型组的黄色斑点、自噬小体、溶酶体明显少于其他组，且黄色斑点少于红色斑点，表明自噬活性较低；中药组的红色和黄色斑点较正常组及中药+地塞米松组减少，提示自噬溶酶体及自噬小体形成受到抑制。LDH及炎症因子检测结果显示：与模型组相比，正常组、中药组、地塞米松组及中药+地塞米松组的LDH漏出率、IL-18、IL-1β、Caspase-1水平均显著降低（P<0.01）；细胞凋亡率、Atg-5、Beclin-1、Caspase-3表达显著增加（P<0.01）；与中药组相比，正常组及中药+地塞米松组的LDH漏出率显著降低（P<0.01），细胞凋亡率、Atg-5、Beclin-1、Caspase-3表达显著增加（P<0.01）。结论 益肾喘宁汤可抑制人支气管气道上皮样细胞的存活，减少细胞自噬和焦亡，并促进细胞凋亡。

关键词

益肾喘宁汤 / 支气管气道上皮样细胞 / 细胞自噬 / 细胞焦亡 / 细胞凋亡