叶用芥菜BjBLH基因家族的鉴定及其在叶形变异中的表达分析

Identification analysis of BjBLH gene family in Brassica juncea and analysis of its expression in leaf shape variation

摘要

针对芥菜BLH基因家族成员是否参与调控芥菜叶形变异的生物学问题，采用生物信息学分析的方法，在全基因组水平鉴定和分析了芥菜BLH基因家族成员。通过基因表达分析，鉴定参与叶形变异的候选基因。研究结果发现，芥菜BLH基因家族主要包含45个家族成员，可分为13个亚家族。45个BLH基因家族成员在除了B07染色体上的其他17条染色体上不均匀分布，且均定位于细胞核。芥菜BLH 基因启动子序列中包含多个与激素反应和非生物胁迫相关的顺式作用元件。芥菜BjBLH家族基因在不同组织中不同表达。其中，BjBLH4-1和BjBLH4-2在裂叶芥菜由内到外的第一、二、三片真叶中的表达含量显著高于锯齿叶芥菜叶片。这两个基因可能参与芥菜叶形的调控。

Abstract

Bioinformatic analysis was used to identify and analyze BLH gene family members of mustard leaf at the whole genome level， and aimed to answer the biological question of whether members of mustard BLH gene family participated in regulating leaf shape variation. After gene expression analysis， candidate genes involved in leaf shape variation were identified. The results showed that the identified 45 BLH genes can be divided into 13 subfamilies. The members of BLH gene family were unevenly distributed on 17 chromosomes except B07 chromosome and all of them were located in the nucleus. The analysis of cis-acting elements in the promoter region showed that the promoter sequence of BLH gene contained several cis-acting elements related to hormonal response and abiotic stress. Mustard BjBLH family genes were expressed differently in different tissues. Among them， the expression content of BjBLH4-1 and BjBLH4-2 in the first， second and third true leaves of split leaf mustard was significantly higher than that in sawtooth leaf mustard leaves. These two genes may be involved in the regulation of leaf shape of mustard.

Graphical abstract

关键词

芥菜 / BLH / 基因家族 / 生物信息学 / 基因表达

Key words

Brassica juncea / BLH / gene family / bioinformatics / gene expression

0 引言

在植物中，根据结构特征可将 Homeobox 转录因子家族成员分为14 类：HD-ZIPⅠ、HD-ZIPⅡ、HD-ZIPⅢ、HD-ZIPⅣ、PLINC、WOX、PHD、DDT、LD、NDX、PINTOX、SAWADEE、KNOX 和 BLH；在 PlantTFDB 中，Homeobox转录因子家族被分为 5 个家族： TALE、HD-ZIP、HB-PHD、WOX 和 HB-other^［1］。而TALE 转录因子家族包含 KNOX 亚家族和BLH 亚家族^［2］。BEL 1-like homeodomain（BLH）基因家族是植物中广泛存在的一类同源结构域转录因子，该基因家族成员编码的同源异型结构域蛋白在植物发育、激素反应和逆境应答中发挥重要的调控作用。

BLH 蛋白包含 POX、Homeobox_KN等2 个结构域，POX结构域是由SKY结构域和BEL结构域组成。其中，SKY结构域是BEL蛋白N端约17个氨基酸的保守区域；Homeobox_KN结构域是BLH蛋白C端一个60个氨基酸的螺旋-角-螺旋DNA结构域，参与DNA结合和同源蛋白二聚体的形成。POX结构域位于Homeobox_KN结构域上游，这2个保守结构域对植物中BLH家族蛋白的功能具有重要意义^［2］。研究表明，BLH蛋白的POX结构域能与KNOX蛋白的MEINOX结构域进行特异性识别和结合，形成BLH-KNOX异源二聚体，这种结合对两种转录因子蛋白的核定位和激活靶基因序列的活性至关重要^［3］。该二聚体可以从细胞质转移到细胞核中。在细胞核中，两个蛋白的Homeobox_KN结构域能与各自的目标序列特异结合，从而实现对下游基因表达水平的调控^［4］。多项研究表明，BLH基因在植物分生组织、花序、种子、果实和叶绿体的发育中起着重要作用^［5-8］。例如，拟南芥BLH家族成员ATH1、PNF/BLH8和PNY/BLH9在调节芽顶端分生组织和花序结构的发育中发挥重要作用^［9］ 。SAWTOOTH1（SAW1/BLH2）和SAWTOOTH2（SAW2/BLH4）负调控I类KNOX基因BREVIRUUS（BP）的表达，导致叶片发育缺陷^［10］。SAW1/BLH2和SAW2/BLH4也通过直接激活PME代谢相关基因58 （PME58），冗余地调节种子黏液中同型半乳糖醛酸的去甲基酯化^［6］。在缺失BELL 1功能的拟南芥bel1突变体中，珠被转变为心皮结构^［11］。BLH1被认作拟南芥胚珠发育的关键调控因子^［11-13］。在马铃薯中，BEL1-KNOX相互作用参与了块茎化过程和根生长^［14-15］。此外，SlBEL11调控番茄果实的叶绿素合成和叶绿体发育^［5］。水稻BLH基因RIL1和RI调控分生组织的维持和花序结构^［8］。大豆中的GmBLH4可能在维持SAM和花器官的发育中发挥作用，也可能参与了成熟种子退化过程^［16］。

芥菜（Brassica juncea）是一种重要的十字花科类经济作物，由白菜（Brassica rapa）和黑芥（Brassica nigra）杂交后自然加倍形成的异源四倍体。芥菜作为世界重要的蔬菜、油料、调料作物，可分为根用、茎用、叶用、薹用芥菜等4大类16个变种，其中叶用芥菜是适应性较强的一个变种，在我国西南、华南、华中、华东等地区广泛种植^［2-4］。目前，BLH家族的全基因组分析已经在多种植物上进行。这些研究已经在拟南芥、桃、棉花和马铃薯等中鉴定出了BLH基因^{［2， 17-19］}。但是，芥菜中的BLH基因尚未得到系统地鉴定和研究。本研究利用生物信息学的方法，在全基因组范围内识别和鉴定叶用芥菜BLH基因家族成员，对其家族成员编码蛋白的理化性质、在染色体中的物理位置、基因结构、启动子区顺式作用元件、系统发育关系、组织特异性表达模式等进行分析。进一步通过qRT-PCR分析芥菜BjBLH2和BjBLH4亚家族成员在叶片发育中的表达情况，初步鉴定其在叶形变异中的调控作用，以期为进一步研究芥菜BLH基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 叶用芥菜<italic>BLH</italic>基因家族成员的鉴定及理化性质分析

为了鉴定BjBLH家族成员，从拟南芥网站下载了13个AtBLH蛋白序列。利用芥菜数据库，以及TBtools Blast及韦恩图去重复等功能^［20］（https：//github.com/CJChen/TBtools），获得候选基因的蛋白序列。随后将所有候选基因编码的蛋白序列导入到Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/）中进行功能域分析，选择包含POX和Homeobox_KN结构域的基因作为芥菜BLH家族基因。同时用Interpro网站（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）进行检验。随后用NCBI中Blastp功能进行一致性和覆盖率分析，最后一共确定了45个成员。根据拟南芥已有的命名方式对BjBLH基因进行重命名。此外，通过ExPASY （https：//www.expasy.org/）在线网站预测了该家族成员编码蛋白质的氨基酸长度、蛋白质分子量、等电点等理化参数。通 过 Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）预测亚细胞定位。

1.2 叶用芥菜<italic>BLH</italic>基因染色体定位分析

根据鉴定出的芥菜 BLH 基因家族成员信息及芥菜基因结构注释信息文件，利用TBtools的 gene location visualize from GTF/GFF 功能进行 BLH 基因家族的染色体定位分析。

1.3 叶用芥菜<italic>BLH</italic>家族成员保守基序、保守结构域和基因结构分析

利用MEME（http：//meme-suite.org/meme/tools/meme）在线工具，分析BjBLH家族的蛋白基序，最大基序检索数目设定为10，其他参数均选择默认值。使用Batch CDSearch（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）进行BjBLH家族的保守结构域分析；使用 TBtools工具对BjBLH基因的内含子-外显子结构进行预测分析；以上结果用TBtools软件进行可视化。

1.4 叶用芥菜<italic>BLH</italic>基因启动子区顺式元件分析

基于芥菜基因注释文件和基因组文件，使用TBtools提取BjBLH基因起始密码子上游的2000 bp序列作为启动子区，将该启动子区域提交PlantCARE数据库 （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/），鉴定顺式元件。

最后利用TBtools 的 simple bioSequence viewer 功能对生成的结果进行可视化分析，以推断BLH基因可能的生物学功能和转录调控。

1.5 叶用芥菜BLH蛋白的系统发育分析与分类

为了对BjBLH蛋白进行分类，对45个BjBLH和拟南芥中13个已报道的AtBLH蛋白序列进行了比对，以JTT + G 模型构建了最大似然（ML）系统发育树。然后根据拟南芥中BLH蛋白的类别对BjBLH蛋白进行分类。

1.6 叶用芥菜<italic>BLH</italic>基因家族在不同组织的表达特性分析

BjBLH 基因家族表达分析使用的转录组数据由本实验室测序完成。转录组数据包括芥菜的根、茎、下胚轴、叶、种子、子叶、角果和花等8个组织。使用TBtools工具绘制热图来研究BjBLH基因在不同组织中的表达。

1.7 叶用芥菜RNA的提取和基因的qRT-PCR分析

供试材料为裂叶芥菜XC和锯齿叶芥菜102B（来源于信阳师范大学生命科学学院）。两种叶用芥菜种子播种于1/2 MS培养基中，生长至14 d时，分别收集裂叶芥菜XC和锯齿叶芥菜102B从内到外的第一、第二、第三片真叶，依次命名为BjL1/BjS1、BjL2/BjS2和BjL3/BjS3。经液氮速冻后存于-80 ℃冰箱保存备用，用于qRT-PCR分析。电泳检测所提取的RNA质量合格后，再利用 TaKaRa的反转录试剂盒PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）进行反转录合成cDNA第一链。操作过程按操作说明进行，获得的叶用芥菜cDNA样品的浓度经 Nanodrop 2000 检测后，用 ddH2O 统一稀释80倍，于-20 ℃冰箱中保存。qRT-PCR反应体系为 2×SYBR PCR mix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，总体系为20 μL。qRT-PCR反应条件为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。需要添加溶解曲线。2^-ΔΔCt计算基因的相对表达量，3次重复做统计学分析，用GraphPad Prism工具作图。qRT-PCR实验所需的引物通过TBtools软件设计。内参基因选用BjActin基因（BjuLA10G024880），实验所用引物见表1。

2 结果与分析

2.1 <italic>BjBLH</italic>基因家族的鉴定及基本特征

对芥菜数据库中的BjBLH序列进行序列比对，结合Interpro网站和pfam数据库来验证POX、Homeobox_KN结构域的存在，在芥菜中共获得45个BjBLH家族成员（表2）。根据拟南芥已有的命名方式对45个成员进行重命名。虽然这些基因属于BLH家族，但它们的大小和理化性质在不同的亚家族中差异很大。蛋白质特性分析发现，45个BjBLH蛋白的氨基酸长度从289 aa（BjBLH9-2、BjBLH11-2）到694 aa（BjBLH2-4），对应的蛋白质分子量范围为32 998.45~76 569.10 Da。等电点（pI）从5.58（BjBLH6-10）到8.85（BjBLH9-4）。亚细胞定位网站分析结果显示45个编码蛋白均定位细胞核，这也与转录因子定位在细胞核调控基因表达的功能相吻合。

2.2 BjBLH基因家族染色体定位

根据芥菜基因组的注释，利用TBtools软件绘制BjBLH基因的染色体分布图，结果显示除了B07染色体，其余17条染色体上都有BjBLH基因分布（图1）。这些成员在整个基因组中分布不均匀，A03、B02染色体上分布的基因最多，多达5个BjBLH基因，而A05、A06、A09、A10、B04染色体最少，仅包含1个基因。

2.3 <italic>BjBLH</italic>基因家族编码蛋白结构及基因结构分析

为了更好地说明BjBLH基因成员的保守结构域模式，使用TBtools来预测BjBLH蛋白中的保守基序，设定搜索出10个motif，分别命名为motif 1—10，其中Motif 3、Motif 4、Motif 5高度保守，在45个BjBLH成员均发现了该基序。结合进化关系与保守基序图（图2），发现进化关系相似的BjBLH家族成员其保守基序分布情况也相似，表明同一组蛋白具有相似的功能。除BjBLH10‑4缺失基序1外，其余成员均有Motif 1、Motif 3、Motif 4和Motif 5，表明它们在BjBLH蛋白中高度保守。其中Motif 4参与组成POX结构域或POX-superfamily结构域，Motif 1组成Homeobox_KN结构域。总体上，大多数BjBLH成员（除了BjBLH10‑4）都包含Homeobox_KN结构域，所有BjBLH成员都具有POX结构域或者POX‑superfamily结构域。基因结构分析发现，除了BjBLH3‑1、BjBLH3‑2、BjBLH3‑4和BjBLH3‑5有3个外显子，BjBLH10‑4有两个外显子，其他BjBLH都有4个外显子。此外，有7个BjBLH基因不含有内含子，BjATH1-1含有1个内含子，其余36个基因有2~3个内含子，推测可能由于芥菜BLH基因在进化过程中丢失了内含子。

2.4 <italic>BjBLH</italic>基因家族启动子顺式作用元件分析

利用PlantCARE数据库预测BjBLH基因启动子顺式元件，对BjBLH所有顺式作用元件及其位点数进行分类和统计发现，BjBLH10‑1 是含有启动子顺式作用元件最多的成员，有41个元件；而BjBLH11-2最少只含有11个元件；其次是BLH5-1含有13个元件，其余基因含有14~38个元件。BjBLH基因家族启动子特征分析表明，其成员上游 2 000 bp 区域存在大量的光响应元件，脱落酸、茉莉酸甲酯、厌氧响应元件（图3）。其中，所有成员都有光响应元件，66.7%的成员包含茉莉酸甲酯响应元件，80.0%的成员包含脱落酸响应元件，53.3%的成员包含赤霉素响应元件， 35.6%的成员包含生长素响应元件，22.2%的成员包含玉米素响应元件，51.1%的成员包含水杨酸响应元件，可见，多种激素响应BjBLH的表达，而不同成员间可能存在协同或者拮抗作用。此外，BjBLH中有 20%的成员包含与分生组织表达相关的响应元件， 28.9%的成员包含低温响应元件，31.1%的成员有防御胁迫响应元件，82.2%的成员包含厌氧的 MYB 结合元件，51.1%的成员包含干旱诱导的 MYB 结合元件， 17.8%的成员含有胚乳表达响应元件，42.2%的成员含有生物周期调节应答元件，还有部分基因拥有创伤、类黄酮生物合成、栅栏叶肉细胞、种子特异性调控等响应元件。以上结果表明，不同响应元件共同调控BjBLH在芥菜中的作用。

2.5 <italic>BjBLH</italic>基因家族系统发育分析

利用MAGA 6软件对45个BjBLH家族成员与AtBLH家族成员（13个已知序列蛋白）构建了一个最大似然系统进化树（图4）。根据拟南芥的亲缘关系，将BjBLH分为13个亚家族，分别是BLH1、BLH2、BLH3、BLH4、BLH5、BLH6、BLH7、BLH8、BLH9、BLH10、BLH11、BEL1和ATH1。其中BLH1和BLH3分支所含BjBLH基因数目最多，共有6个；而BLH5、BLH6、BLH7、BLH8和BLH11分支仅含有2个BjBLH基因；其余的几个亚家族含有2~3个BjBLH基因。根据系统进化关系，推测亲缘关系较近基因之间存在相似的生物学功能。

2.6 <italic>BjBLH</italic>转录因子在不同组织中的表达谱

为了探究芥菜中BLH基因在芥菜不同组织器官中的表达模式，根据芥菜不同组织的转录组数据，分析了45个BjBLH基因的表达水平。结果显示，不是所有的BjBLH 基因在芥菜根、茎、下胚轴、叶、种子、角果、子叶和花等组织中都能检测到表达（图5），且不同组织中BjBLH基因的表达水平存在显著差异。其中，BjBLH1‑3在叶、种子和子叶中未检测到表达，BjBLH5‑1在下胚轴、叶、种子和子叶未检测到表达，BjBLH5‑2在下胚轴中未检测到表达，BjBLH11‑1在茎和叶中未检测到表达，BjBLH11‑2在茎、下胚轴和种子中未检测到表达，BjBEL1‑2下胚轴、种子和花中未检测到表达，BjATH1‑1在下胚轴、叶和种子中未检测到表达，BjATH1‑2在下胚轴和子叶中未检测到表达，BjATH1‑4在根、茎和下胚轴中未检测到表达。结果还显示大多数基因在茎、角果和花组织中高表达，仅少数基因如BjBLH1‑2、BjBLH2‑1、BjBLH4‑2、BjBLH4‑4和BjATH1‑4在叶中有高表达。此外，相较于其他成员，BjBLH2和BjBLH4亚家族成员在子叶中表达量较高。以上芥菜BLH基因家族成员的差异表达模式表明，这些基因可能在芥菜的营养生长时期和生殖生长时期发挥不同作用。

2.7 <italic>BjBLH</italic>在真叶不同发育时期下的表达

叶片形状是叶用芥菜的重要农艺性状。组织特异性表达分析发现，BjBLH2和BjBLH4亚家族成员相较于其他成员在叶和子叶中的表达量较高，因此选择了属于BjBLH2和BjBLH4亚家族的8个基因（BjBLH2‑1、BjBLH2‑2、BjBLH2‑3、BjBLH2‑4、BjBLH4‑1、BjBLH4‑2、BjBLH4‑3和BjBLH4‑4），利用qRT-PCR试验检验其在裂叶（BjL）和锯齿叶（BjS）芥菜由内到外的第一、二、三片真叶的表达水平（依次命名为BjL1/BjS1、BjL2/BjS2和BjL3/BjS3），探究芥菜BjBLH2和BjBLH4亚家族基因是否参与叶形变异的调控，结果表明（图6），8个BjBLH基因在BjL1/BjS1、BjL2/BjS2和BjL3/BjS3中的表达模式可以分为两类：第一类有6个基因，分别是BjBLH2‑1、BjBLH2‑2、BjBLH2‑3、BjBLH2‑4、BjBLH4‑3和BjBLH4‑4，其在BjS1中表达量均高于BjL1，然而随着真叶的发育，这5个基因在BjL3中的表达含量显著高于BjS3（除了BjBLH4‑4）；第二类有2个基因，分别是BjBLH4‑1、BjBLH4‑2，在真叶发育过程中，这两个基因在BjL中的表达含量始终明显高于BjS。因此BjBLH2和BjBLH4这两个亚家族的基因可能参与芥菜叶形变异的调控，其中BjBLH4‑1和BjBLH4‑2这两个基因对于芥菜叶形的变异有显著的调控作用。

3 讨论

BLH基因家族广泛存在于植物基因组中，其在植物生长发育、分生组织形成和维持器官形态发生方面等诸多生物学过程中起着非常重要的作用^［3］。近年来，随着生物技术和生物信息学技术的快速发展，拟南芥、桃、棉花、豌豆和蒺藜苜蓿等植物中的BLH基因家族成员已被全基因组鉴定和研究^{［3， 17-18， 21］}。然而，叶用芥菜BjBLH基因家族成员的全基因组鉴定和表征仍然缺乏。本研究通过对芥菜全基因组数据库的检索与筛选，在芥菜中鉴定得到45个BjBLH基因家族成员，分布在17条染色体上，并且BjBLH基因家族成员在每条染色体上的分布并不均匀，进一步分析其保守结构域和基因结构，发现芥菜BjBLH基因家族成员高度保守。分析 BLH 家族成员的氨基酸序列进化关系、基因序列结构和氨基酸保守基序发现，系统发育进化树中关系紧密的成员外显子长度相似，含有相似基因结构的成员氨基酸保守基序也相似。启动子区域的顺式作用元件分析发现BLH 基因启动子序列包含多个与激素反应和非生物胁迫相关的顺式元件，富含光、茉莉酸甲酯、脱落酸、水杨酸、赤霉素、生长素、干旱胁迫等响应元件，还有部分基因含有创伤、分生组织、生物周期等响应元件，表明芥菜BLH基因家族参与光合作用、生长发育等过程，同时也与芥菜逆境胁迫调控有关。

芥菜BjBLH基因在不同组织中均有不同程度的表达，暗示着BjBLH在不同发育过程和不同组织中可能发挥不同作用，与特定的基因表达调控有关，具体功能还需要进一步验证。已有研究报道， 拟南芥中BLH2和BLH4基因高度同源，过表达BLH2会导致植物整体形态较小，叶片极性丧失。而BLH2、BLH4双突变体导致锯齿状叶缘和叶缘外旋，表明这两个基因冗余影响叶缘生长^［10］。系统进化关系表明BjBLH家族进化关系与AtBLH相似，在进化过程中高度保守，因此推测芥菜中BjBLH2和BjBLH4亚家族也可能参与叶形变异的调控。故对这两个亚家族进行了深入分析，裂叶芥菜第一、二、三片真叶中的表达含量始终远大于锯齿叶芥菜第一、二、三片真叶中的表达含量，qRT-PCR试验结果表明， BjBLH4‑1和BjBLH4‑2这两个基因裂叶芥菜由内到外的第一、二、三片真叶中的表达量始终显著高于锯齿叶芥菜，这两个基因可能参与芥菜裂叶的形成。本研究结果为进一步研究BLH基因家族在植物生长发育中的调控作用提供了理论基础。

4 结束语

利用生物信息学方法，基于叶用芥菜雪里蕻全基因组数据，总共鉴定了芥菜BLH基因家族包含45个基因。对其理化性质、染色体定位、基因结构、启动子、基因表达调控等进行分析。通过qRT-PCR分析发现BjBLH4‑1和BjBLH4‑2在裂叶中的表达含量始终高于锯齿叶。BjBLH4‑1和BjBLH4‑2可能参与叶用芥菜叶形变异的调控。未来将通过基因编辑等实验进一步验证其基因功能。研究结果为进一步解析BLH基因家族的功能以及叶用芥菜的生长发育提供重要的参考，为芥菜叶形的遗传改良和分子育种提供理论支持。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32002056)

河南省自然科学基金项目(232300420021)