金银花乙酸乙酯部位对湿疹小鼠治疗作用

Effect of ethyl acetate site of Lonicera japonica thunb in mice with eczema

摘要

针对金银花治疗湿疹的作用机理尚未被科学证实的问题，采用2，4-二硝基氯苯（DNCB）诱导C57BL/6小鼠产生湿疹反应的方法，给予金银花乙酸乙酯部位对湿疹小鼠进行治疗，研究了湿疹小鼠疾病相关的免疫因子、皮肤病理切片、皮肤细胞凋亡等指标，得出来金银花清除了湿疹小鼠血清中的IgE、IL-4和IL-17等细胞因子的水平，提高了免疫因子CD4+水平，减轻小鼠湿疹引起的棘层过度增生、减少炎性细胞的浸润和组织水肿，促进角质层细胞的凋亡，湿疹小鼠的症状得到了一定的改善。实验结果显示：金银花乙酸乙酯部位通过抑制炎症细胞的产生、调节免疫因子等方式来治疗湿疹。

Abstract

For the treatment of eczema has not been scientifically confirmed， 2，4-dinitrochlorobenzene （DNCB） was used to induce eczema reaction in C57BL/6 mice， and eczema mice were treated with ethyl acetate to study the disease of eczema mice related immune factors， skin pathology slices， skin cell apoptosis indicators. The results showed that the honeysuckle cleared eczema mice serum of IgE， IL-4 and IL-17 levels， the level of CD4 + immune factors was improved， the mouse eczema caused by spine hyperplasia was reduced， the infiltration of inflammatory cells and tissue edema was reduced， also the apoptosis of keratinocytes was promoted， the symptoms of eczema mice had been certain improvement. The experimental results also showed that the ethyl acetate site of honeysuckle treated eczema by inhibiting the production of inflammatory cells and regulating immune factors.

Graphical abstract

关键词

金银花 / 乙酸乙酯萃取 / 湿疹治疗 / 免疫调节 / 细胞凋亡

Key words

Lonicera japonica Thunb / ethyl acetate extraction / eczema treatment / immune regulation / cell apoptosis

0 引 言

湿疹是一种反复发作的真皮浅层及表皮的炎症，皮损为暗红或棕红色斑或丘疹斑，呈苔藓样变，伴有剧烈瘙痒，抓挠时还会引起皮肤变红、渗液、增厚等，夜间加重，极易复发^［1-3］。严重影响患者生活质量，给患者家庭和社会造成沉重的负担。贵州特殊地域气候，容易高发诱导湿疹，湿疹的发病率在一般人群中占7.5%左右，而婴儿的发病率却高达20%~30%。婴儿湿疹是该病的高发人群，与遗传、环境、免疫因素等有关，多发于患儿头、面部，严重时亦可累及四肢、躯干等，如不及时治疗，可能会对患儿的生长发育和身心健康产生不良影响。西医一般采用口服或外用激素治疗湿疹，效果快但副作用大，激素对婴幼儿的副作用高于成年人。中医治疗湿疹的目的是控制症状、减少复发、提高患者生活质量，具有疗效确切、副作用小的优点。中医常采用口服或外用药物治疗湿疹，虽然见效慢，但副作用小，不反弹。

金银花（Lonicera japonica Thunb）又名忍冬，是传统药食两用药材，来源于忍冬科（Lonicera ）植物的干燥花蕾或初开的花蕾，在全国各地均有广泛分布，尤其在贵州省的黔西南、黔南、黔东南等地，作为农业林下经济作物，被大面积地推广种植。本研究采用的金银花原料，源自遵义市道真仡佬族苗族自治县，经贵州中医药大学孙庆文教授的严谨鉴定，确认为忍冬科植物的初开干燥花蕾，保证了研究材料的准确性与纯正性。

金银花在民间医药中的应用历史源远流长，众多文献报道了其具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤以及增强免疫等多重生物活性^［4-9］。金银花在治疗湿疹方面，已有文献指出金银花口服具有一定的疗效。金银花复杂的化学成分，包括黄酮、皂苷、有机酸、挥发油等^［10-13］，为其多样的药理作用提供了物质基础。然而，尽管金银花在治疗湿疹方面的效果已有初步探索^［14-17］，但其具体发挥治疗作用的有效部位或有效成分尚未明确。

本课题组在前期的研究中，创新性地尝试将金银花外用于治疗湿疹小鼠。在实验过程中，发现金银花水提物经不同溶剂萃取后，乙酸乙酯部位的活性在治疗湿疹方面表现尤为突出，甚至超过了总水提物的效果。这一发现激发了对金银花乙酸乙酯部位（The ethyl acetate site of Lonicera japonica Thunb，LJT）治疗湿疹活性的深入研究兴趣。

基于以上背景和前期研究结果，本研究深入探究金银花水提物的乙酸乙酯部位在治疗湿疹方面的具体活性，并对其可能的作用机制进行初步分析，为金银花在治疗湿疹方面的临床应用提供更坚实的理论依据，有望为这一传统药材的更广泛应用开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 实验仪器及材料

电子天平 （梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；高速离心机（德国Eppendorf公司）；酶标仪（德国Eppendorf公司）；旋转蒸发仪（日本东京理化公司）。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（均为分析纯，天津富于化学试剂有限公司）。ELISA酶联免疫试剂盒（武汉博士德生物科技有限责任公司）。金银花药材采自贵州省道真仡佬族苗族自治县，经贵州医科大学孙庆文教授鉴定为忍冬科植物的干燥初开花蕾。C57BL/6小鼠，雄性，由重庆腾鑫实验动物中心提供，合格证号SCXK（辽）2023-0001，体质量（18±2） g。

1.2 实验方法

1.2.1 金银花乙酸乙酯部位的制备

取金银花药材2 kg，加入30倍药材质量的水，煎煮3次，合并滤液，浓缩至有沉淀析出，加入石油醚萃取3次，至石油醚萃取液在硅胶薄层板上无斑点呈现，再加入乙酸乙酯适量萃取至乙酸乙酯萃取液在硅胶薄层色谱上无斑点呈现，同样的方法加入正丁醇萃取，浓缩每次的萃取液至浸膏，将金银花分为石油醚部位（0.3 g）、乙酸乙酯部位（20 g）、正丁醇部位（1.6 g）和剩余水部位（28 g）等4个乙酸乙酯部位，称取每个部位的浸膏适量，加入0.5 %的羟甲基纤维素钠溶液，将每个乙酸乙酯部位制成给药剂量100 mg/mL的混悬溶液，再进行湿疹治疗活性筛选，最后确定活性部位为乙酸乙酯部位。

1.2.2 金银花乙酸乙酯部位给药剂量的确定及模型的建立

将金银花水提物乙酸乙酯部位经给药剂量筛选后，最终确定给药剂量为50 mg/kg（低）、100 mg/kg（中）、200 mg/kg（高）；利用0.5 %的羧甲基纤维酸钠溶液配制成混悬溶液。模型建立^［18］：将60只雄性C57小鼠，4~6周龄，适应性饲养一周后，除空白组10只以外，其余小鼠每组腹部剃毛2 cm×2 cm，给予小鼠腹部涂抹7%的DNCB-丙酮溶液100 μL，致小鼠发生迟发型超敏反应，连续涂抹3 d，造成小鼠慢性皮炎-湿疹模型。随后按体重将造模后的小鼠分为模型组（model）、阳性对照复方地塞米松软膏组（positive）和金银花乙酸乙酯部位低（50 mg/kg LJT-L）、中（100 mg/kg LJT-M）、高（200 mg/kg LJT-H）组，每组10只，于造模后第5 d，在小鼠背部剃毛3 cm×3 cm区域，每天在小鼠双侧耳郭涂抹 1%的DNCB-丙酮溶液10 μL，每隔4 d在背部涂抹100 μL致敏一次，造模第5 d后按分组给予每组小鼠相应的药液，涂抹小鼠背部致敏处（1 mL/只），连续给药28 d，最后一次给药在小鼠右侧耳部再涂抹1 %的DNCB-丙酮溶液10 μL。

1.2.3 指标检测

表观评分^［19］：于实验结束当天，观察每组小鼠皮肤愈合情况，给予评分并拍照，验证LJT对C57小鼠湿疹的治愈情况。评分标准为：无红斑计0分，轻微红斑计1分，明显红斑无痂皮计2分，中度红斑伴轻、中度痂皮计3分，重度红斑伴重度痂皮计4分；无水肿计0分，轻度水肿计1分，中度水肿计2分，重度水肿计3分；无抓痕计0分，有抓痕计1分。总评分为上述各项评分累计之和。耳郭肿胀度测定：实验结束后处死小鼠，剪去小鼠双侧耳片，用直径0.8 cm的金属打孔器在左、右耳中部的同一位置打孔取圆形耳片，立即用万分之一天平称重，并计算耳肿胀度，肿胀度（mg）=右耳片质量（mg）-左耳片质量（mg），并计算肿胀抑制率，耳肿胀抑制率（％）=（模型组耳肿胀度-给药组耳肿胀度）/模型组耳肿胀度×100％。小鼠血清中免疫因子的含量检测：取小鼠眦静脉血清，EILSA试剂盒测定血清中的IgE、辅助性CD4+T细胞（CD4+）、IL-4、IL-17等细胞因子的含量。小鼠患处组织切片观察：实验结束后取小鼠背部造模部位的皮肤做病理切片苏木精-伊红染色（HE）及免疫荧光TUNEL染色。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0版本对数据进行分析，结果以平均值（͞x ± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。

2 结果与讨论

2.1 湿疹小鼠治疗作用表观得分

连续给药28 d后，观察各组小鼠外观恢复情况见表1和图1。

根据表观评分标准，可以看出，从外表上观察，LJT对DNCB所致的小鼠慢性湿疹有较好的治疗作用，模型组小鼠表皮增厚，有红斑、有结痂、并伴随抓痕，表皮毛糙不光滑；阳性对照组小鼠表皮无抓痕、无红斑，表皮光滑，但表皮有大量增厚、有痂皮，毛发生长慢；LJT-H治疗28 d后基本已痊愈，患处皮肤无结痂无增厚现象，表皮光滑，无红肿、无抓痕，表观得分优于阳性对照组，但无统计学差异（P>0.05），极显著优于模型组（P<0.01）。LJT-L组小鼠有少量红斑及抓痕，表皮无增厚，无痂皮，大部分毛发已长出；LJT-M组少量抓痕，表皮无增厚、无红斑，表皮光滑，与模型组比较，著优于模型组（P<0.01）。

2.2 湿疹小鼠耳郭肿胀度变化

从表2的结果可以看出，与空白组比较，模型组小鼠激发后左、右耳厚度差既肿胀度均明显增加（P<0.01）。而阳性对照组与LJT各组厚度差有所降低，与模型组比较，LJT-M、LJT-H组小鼠耳郭肿胀度极显著下降（P<0.01）；LJT-L与模型组比较有显著性差异（P<0.05），因此，可知LJT具有改善湿疹小鼠耳郭肿胀度。

2.3 湿疹小鼠血清中的免疫因子变化

IgE是血清中的免疫球蛋白，主要介导Ⅰ型变态反应，在正常动物血清中的含量低，当IgE含量增高时，说明体内发生了超敏反应。由图2a结果显示，DNCB造模后，血清中的免疫球蛋白IgE含量升高，与空白组相比，模型组的IgE含量极显著升高（P<0.01），说明模型建立成功。当给予药物治疗后，小鼠血清中的IgE含量有所降低，与模型组比较，阳性对照组及LJT各组小鼠IgE含量均显著降低（P<0.01），其中阳性对照组及LJT-H组小鼠血清中的IgE含量恢复到正常水平。

CD4+细胞是人体免疫系统中的一种重要免疫细胞，当免疫系统遭到破坏后，CD4+的含量有所下降。图2b数据表明，造模后，血清中的免疫细胞CD4+含量会下降，模型组小鼠血清中的CD4+含量显著低于空白组（P<0.01），说明造模，给药后，小鼠血清中CD4+含量有所上升，LJT各组小鼠CD4+含量与模型组比较，均高于模型组，且差异极显著（P<0.01）。

IL-4和IL-7是白细胞介素家族中的两个重要因子，当它们的含量高于正常水平时，说明机体发生严重的炎症反应。图2c、d数据说明造模后，各组小鼠血清中的IL-4、IL-17均上升，与空白组比较，模型组含量极显著上升（P<0.01），当给予LJT治疗后，小鼠血清中的1L-4、IL-17含量均有所下降，LJT-L组下降的幅度显著低于模型组（P<0.01），LJT-M、LJT-H到正常组水平。说明LJT能显著下调湿疹小鼠血清中的免疫球蛋白IgE，调高免疫细胞CD4+含量的作用，对炎症因子IL-4、IL-17有清除的作用。

2.4 LJT对湿疹小鼠组织病理学的影响

图3结果说明，空白组小鼠皮肤表皮结构完整，真皮层纤维排列整齐，模型组小鼠表皮增厚，表层突下延；角质层可见角化不全和角化过度，真皮层有炎症细胞浸润；组织轻度水肿，棘层颗粒层明显肥厚，LJT-L组有少部分表皮角质化增厚、少量炎症细胞浸润，组织水肿现象减少，LJT-M、LJT-H组棘层增生较模型组消退，未见炎性细胞浸润，表皮结构趋于正常，从HE病理切片结果可以看出，LJT以改善湿疹小鼠的皮肤组织结构，使皮肤组织结构趋于正常。

图4是LJT对湿疹小鼠皮肤细胞的影响。

从图4可知，当小鼠造模后，棘层增厚，角质层增厚，经TUNEL免疫荧光染色分析发现，皮肤患处细胞的细胞核可见角质层（蓝色荧光），而给药后，出现了大量的细胞凋亡（绿色荧光），结合文献［19-21］及HE染色可判断，凋亡的细胞可能为肥大细胞和角质层细胞，而正常组小鼠未发生炎症反应，因此组织无皮肤角质化和炎症细胞，未出现大量细胞凋亡的现象，而模型组未经药物治疗，角质层增厚的细胞和肥大细胞的增殖未得到控制，因此，未出现细胞凋亡的现象，而给予阳性对照药及LJT治疗后，出现大量的角质层细胞及肥大细胞凋亡（图5）。LJT通过促进角质层增生的细胞与促炎症细胞的凋亡，达到治疗湿疹的作用。

3 结论

金银花乙酸乙酯部位外用在小鼠模型中具有显著的免疫调节和抗炎作用。通过降低小鼠体内的免疫蛋白IgE水平，减少炎症因子IL-4和IL-6的含量，同时增加免疫细胞CD4+的数量，提升了小鼠的免疫功能。此外，该乙酸乙酯部位还能诱导过度增殖的角质化细胞和炎症细胞凋亡，促进皮肤组织结构趋于正常化，从而显著改善湿疹症状。这些发现为金银花水提物在治疗皮肤炎症性疾病中的应用提供了有力的科学依据，展示了其作为一种天然、安全且有效的治疗药物的潜力。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82460764)

贵州省科技计划项目（黔科合成果［2023］一般063）

贵州省科技支撑计划项目（黔科合支撑［2022］一般171）