γ-谷氨酰甲胺合成酶催化L-茶氨酸合成的分子动力学模拟

Molecular dynamics simulation on L-theanine synthesis catalyzed by γ-glutamylmethylamine synthetase

摘要

鉴于γ-谷氨酰甲胺合成酶催化L-谷氨酸和乙胺合成L-茶氨酸的催化机制尚未清楚，通过对γ-谷氨酰甲胺合成酶与谷氨酸和乙胺等底物分子对接，完成了其分子动力学模拟过程，分析了γ-谷氨酰甲胺合成酶对底物ATP、谷氨酸和乙胺的结合模式，并探讨了γ-谷氨酰甲胺合成酶催化L-茶氨酸合成的机制，进一步完善了该酶的催化机理，为构建高产L-茶氨酸的工程菌株奠定基础。

Abstract

Given that the catalytic mechanism of γ-glutamylamine synthetase in synthesizing L-theanine from L-glutamic acid and ethylamine remains unclear， molecular dynamics simulations were performed through docking γ-glutamylamine synthetase with substrate molecules such as glutamic acid and ethylamine. The binding modes of γ-glutamylamine synthetase to the substrates ATP， glutamic acid， and ethylamine were analyzed. Additionally， the mechanism of γ-glutamylamine synthetase in catalyzing the synthesis of L-theanine was explored， further refining the catalytic mechanism of this enzyme. This research endeavor establishes a fundamental basis for the construction of engineered strains that produce high yields of L-theanine.

Graphical abstract

关键词

L-茶氨酸 / γ-谷氨酰甲胺合成酶 / 分子动力学 / 催化机制

Key words

L-theanine / γ-glutamylmethylamine synthetase / molecular dynamics / catalytic mechanism

0 引言

L-茶氨酸（L-theanine）化学名为N-乙基-γ-L-谷氨酰胺，是存在于茶树中的一种重要的非蛋白氨基酸，约占茶叶总游离氨基酸的50%~60%，最早由日本学者于1950年首次在玉露绿茶中分离得到，并将其命名^［1］。茶氨酸的存在，使得茶叶具有鲜美的味道和独特的风味，其含量在很大程度上影响茶叶的质量和价格。茶氨酸对人体有很大的益处，它能缓解压力及改善睡眠质量^［2-4］，与咖啡因一起使用时，有提高注意力及认知能力方面的作用^［5］。同时，L-茶氨酸在医疗方面有着降低血压、抵抗肿瘤、预防心脑血管疾病等作用^［6］。L-茶氨酸已被美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）列为一般公认安全物质（GRAS），现已作为食品药品添加剂广泛应用于食品、饮料和制药等行业。恒州博智发表的《2020—2026全球及中国L-茶氨酸行业发展现状调研及投资前景分析报告》指出，全球L-茶氨酸生产市场预计到2025年达到1 226.94吨，具有极大的市场潜力。因此提高工业化生产L-茶氨酸的能力愈发重要。

目前，工业化生产L-茶氨酸的主要方法包括植物分离提取法、化学合成法和生物转化法^［7］。L-茶氨酸最早是从茶树中分离纯化获得，但是存在纯度低、产量低的问题。此后，化学合成是L-茶氨酸广泛的生产方法，许多工厂都使用这种方法生产茶氨酸，但通过化学合成方法生产的L-茶氨酸的纯度仅约为90%，且化学合成法会产生外消旋化合物DL-茶氨酸，同时可能引入一些有害物质，不符合现在人们追求的绿色健康理念。随着生物技术的发展和应用，生物转化法生产L-茶氨酸的技术由于其催化效率高、安全环保等特点日益受到重视^［8］。γ-谷氨酰甲胺合成酶（GMAS， EC 6.3.4.12）是生物转化法合成L-茶氨酸的一种重要的酶，它可以在ATP供能的情况下催化L-谷氨酸和乙胺的连接反应合成L-茶氨酸^［9］，具体反应式如图1所示。

GMAS最早是从噬甲基菌株Methylophaga sp. AA-30中分离鉴定出来的，它可以催化L-谷氨酸和甲胺合成N-甲基-L-谷氨酰胺，在甲胺代谢途径中发挥重要作用^［10］。该酶在pH 7.5和40 ℃条件下活性最强，并具有较宽的底物特异性范围，研究发现它还能以L-谷氨酸和乙胺催化合成L-茶氨酸，但其催化机制尚未进行深入研究。2019年，潘鑫茹等^［11］在大肠杆菌中共表达了多聚磷酸盐激酶（PPK）和来源于Methylovorus mays No. 9的GMAS，建立了L-茶氨酸合成的全细胞催化系统。CHO等^［12］使用海藻酸钠固定化共表达PPK和GMAS的全细胞，在仅使用15 mmol/L ATP的情况下，茶氨酸产量达到了41.6 g/L，转化率为79.7%。近年来，利用微生物发酵直接生产L-茶氨酸的研究越来越受关注。目前，利用代谢工程将不同来源的GMAS分别在大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和恶臭假单胞菌中进行异源表达，已成功实现了葡萄糖到L-茶氨酸的从头发酵生产^［13-17］，并省去了烦琐的酶纯化过程，具有更好的工业应用前景。但是目前报道的GMAS催化L-谷氨酸和乙胺合成L-茶氨酸的效率较低，仍然是一个亟待解决的问题，使得L-茶氨酸产量难以大幅度提高，限制了L-茶氨酸的工业化生产。

鉴于GMAS催化L-谷氨酸和乙胺合成L-茶氨酸的催化机制尚未清楚，本研究基于分子动力学模拟探究γ-谷氨酰甲胺合成酶催化L-茶氨酸合成的机制，分析复合体的均方根偏差（Root Mean Square Deviation，RMSD）、均方根涨落（Root Mean Square Fluctuation，RMSF）、回转半径（Radius of Gyration，Rg）及溶剂可及表面积（Solvent Accessible Surface Area，SASA），并对其结合自由能分解，研究其与底物分子的结合模式，期望能够进一步完善该酶的催化机理并提高其催化效率，为茶氨酸的研究及开发奠定基础。

1 分子动力学建模

选择PDB编号为7CQW的蛋白作为靶点蛋白。首先，用Pymol把晶体结构中的ADP改为ATP。然后，用AutoDock vina软件进行^［18］分子对接，小分子的结构由数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下载，并用Chem3D16进行结构优化。采用全局对接，对接盒子包裹整个7CQW蛋白，其他参数保持默认。进行100 ns的分子动力学（molecular dynamics， MD）模拟，并用g_mmpbsa^［19］计算蛋白和配体的结合自由能。选择分子对接结果中能量最低的构象作为分子动力学的初始结构。分子动力学模拟采用Gromacs2019.4软件，在恒温恒压以及周期性边界条件下进行。应用Amber99sb-ildn力场，TIP3P水模型。小分子的力场参数由AmberTools中的acpype.py脚本生成^［20］。在分子动力学模拟过程中，涉及氢键采用LINCS算法进行约束，积分步长为2 fs。静电相互作用采用（Particle-mesh Ewald）PME方法计算，截断值设为1.2 nm。非键相互作用截断值设为1 nm。采用V-rescale温度耦合方法控制模拟温度为300 K，采用Berendsen方法控制压力为100 000 Pa。在300 K下分别进行100 ps的NVT与NPT平衡模拟。最后，对蛋白-配体复合物体系进行100 ns的成品MD模拟，模拟结果可视化采用Gromacs内嵌程序和Pymol 2.4完成^［21］。

2 模拟体系的稳定性分析

如图2所示，图2a为模拟时间内蛋白配体体系RMSD值随时间的变化关系，均方根偏差表示某一时刻的构象与目标构象所有原子偏差的加和，是衡量体系是否稳定的重要依据。从图2a中可以看出0~10 ns时间段内，体系的RMSD值有一个较大的上升，可能是蛋白与溶剂的相互作用导致，在10~60 ns时间段内，体系的RMSD趋于稳定。在60~100 ns达到一个平衡，在此时间内的RMSD平均值为（0.484±0.008） nm，整个体系的RMSD值收敛，体系达到平衡。图2b为蛋白氨基酸残基的RMSF值，均方根涨落可以表示蛋白质氨基酸残基的柔性大小。从图2b中可以看出140~160、285~300、360~370、415~430位的氨基酸残基的RMSF值较大，这些区域的柔性较大，可能与此区域的二级结构构象有关，这些区域的二级结构为无规卷曲（random coil）。图2c为蛋白的Rg值，回转半径可以用来描述整体结构的变化情况，Rg变化越大表明体系越膨胀。蛋白整体的Rg值是一个下降的趋势，表明整个蛋白的稳定性逐渐提高。体系的Rg值在65~100 ns时间段内达到收敛，Rg的平均值为（2.149±0.005） nm。图2d为蛋白的SASA值，溶剂可溶及表面积随时间的变化，在模拟的初始时间蛋白的溶剂可及表面积为（192.680±1.006） nm²，随着模拟的进行，溶剂可及表面积逐渐下降，在65~100 ns时间段内逐渐趋于稳定平均值为（188.640±2.210） nm²。溶剂可及表面积的减少，可能是由于蛋白与溶剂相互作用、疏水性氨基酸残基侧链向蛋白内部移动有关，最后溶剂可及表面积收敛表明结构达到稳定。

3 结合自由能分解

为了评估GMAS与底物小分子之间的结合能力，通过MM-GBSA方法^［22］计算了GMAS 与底物小分子的结合自由能。GMAS与底物小分子之间总的结合能和各能量分解项如图3所示。

由图3可知，复合物体系的结合自由能为-19.35 kJ/mol。将结合自由能分解到各项中，发现静电能（-40.12 kJ/mol）对结合自由能的贡献最大，其次是范德华自由能（-22.24 kJ/mol），而极性溶剂化能（50.26 kJ/mol）不利于GMAS与底物小分子之间的结合。同时，为了确定GMAS与底物小分子结合的关键残基，明确复合物体系中重要的相互作用，对每个残基进行了能量分解。表1列举了对结合自由能贡献的主要氨基酸残基。从表1中可以看出，Asp320对结合自由能的贡献值为3.213 kJ/mol，不利于两者的结合。对结合自由能贡献最大的氨基酸残基包括Glu122、Glu325、Glu186，结合自由能分别为-3.014 kJ/mol、-2.613 kJ/mol、-1.753 kJ/mol。

4 底物与GMAS的结合模式

为了明确GMAS与底物小分子相互作用的细节，进行了自由能面图（Free Energy Landscape，FEL）^［23］，提取能量最低的构象作为整个动力学模拟的代表性构象，以展示GMAS 与底物小分子的结合模式。如图4所示，Ser293、Tyr191、Arg323、Arg317、Arg312、Glu186与ATP分子形成7个氢键，其中Arg317与ATP分子形成2个氢键。小分子谷氨酸与Asp177、Glu179形成2个氢键，与乙胺形成1个氢键。动力学模拟之后乙胺偏离原对接位置，可能是由于小分子乙胺在该位置的亲和性不高，参与反应之后偏离原来结合位置。

图5为动力学模拟之后ATP分子、谷氨酸小分子与蛋白的稳定相互作用模式，谷氨酸的氨基和羟基与ATP分子的磷酸基团形成2个氢键，进一步分析ATP分子与周围的氨基酸残基相互作用可以看出，Glu175、Asn188、Arg323、Ser239与ATP分子之间形成氢键，Tyr174、Asp190与ATP分子之间存在Pi-Alkyl、Alkyl疏水作用，Arg323的烷基碳原子与ATP分子的苯环之间存在Pi-Alkyl，同时，该苯环与Tyr191的苯环之间存在π-π疏水作用。

5 讨论与结语

GMAS在溶液中由2个六聚体环组成的十二聚体，每个环包含6个单体^［24］。分子动力学模拟发现Ser293、Tyr191、Arg323、Arg317、Arg312、Glu186、Asp177、Glu179是参与GMAS催化的关键氨基酸残基。ATP首先通过氢键结合在GMAS中，Ser293、Tyr191、Arg323、Arg317、Arg312、Glu186扮演重要角色，导致柔性环（Lys287-Ile305）的构象发生改变，这对于谷氨酸的后续结合至关重要，谷氨酸可与Asp177、Glu179形成2个氢键与GMAS结合。在GMAS的催化过程中，与ATP结合的残基Arg312参与ATP的γ-磷酸化并且稳定γ-磷酸戊二酰中间体；与谷氨酸结合的Asp177负责乙胺的去质子化，协助乙胺攻击γ-磷酸戊二酰生成四面体中间体；最后Glu186从四面体中间体中抽出1个质子，生成L-茶氨酸。动力学模拟发现乙胺偏离原对接位置，可能是由于小分子乙胺在该位置的亲和性不高，因为GMAS本身是负责催化L-谷氨酸与甲胺发生结合反应的酶，说明GMAS与乙胺的结合能力较低，这也是GMAS催化L-谷氨酸与乙胺生成L-茶氨酸效率较低的原因，因此提高GMAS与乙胺的亲和能力是增强GMAS茶氨酸合成能力的重要手段。TAOWEI^［16］等从Paracoccus aminovorans中分离出γ-谷氨酰甲基酰胺合成酶（PaGMAS），并通过计算机辅助设计对其进行工程化改造，得到的E179K/N105R突变体和乙胺表现出更强的亲和力，使L-茶氨酸的产量提高了36.61%。

本研究中通过分子动力学模拟鉴定的GMAS关键氨基酸位点及功能还需要通过实验进行验证，后续也可进一步开展 GMAS的半理性设计，如对不利于底物结合的Asp320和Arg359等位点进行突变，构建GMAS关键位点的饱和突变体库，筛选出对关键底物谷氨酸和乙胺的结合能力更强的GMAS突变体，从而提高GMAS合成L-茶氨酸的催化效率。此外，随着计算机学科和人工智能的快速发展，研究人员可以利用机器学习技术，分析GMAS的结构和功能数据，识别出影响GMAS酶活的关键氨基酸残基，筛选有效的突变体以及辅助参数和环境优化等方法，可以进一步提高GMAS的活性和稳定性。

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基金资助

国家自然科学基金项目(22208276)

河南省高等学校重点科研项目计划(23A416003)

河南省高等学校重点科研项目计划(25CY032)

信阳师范大学青年基金项目(2023-QN-050)