鸡TGF‑β1原核表达及多克隆抗体的制备

Prokaryotic expression of chicken TGF‑β1 and preparation of polyclonal antibody

摘要

旨在制备鸡转化生长因子β1（Transforming growth factor β1， TGF‑β1）的多克隆抗体。首先，以马立克病病毒转化的T淋巴细胞系MSB1细胞的mRNA为模板，通过RT‑PCR技术扩增鸡TGF‑β1基因的完整CDS区，将其连接至原核表达载体pET‑32a（+）中，构建重组表达质粒pET‑32a‑TGF‑β1；随后，将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21中进行诱导表达，采用亲和层析法对表达蛋白进行纯化；接着，利用免疫家兔制备多克隆抗体，并通过间接ELISA检测抗体效价，通过Western blot技术和间接免疫荧光检测来评价多克隆抗体的特异性。结果表明，重组原核表达质粒pET‑32a‑TGF‑β1构建成功，经IPTG诱导后获得约65 kDa的重组蛋白；免疫家兔获得TGF-β1抗血清，ELISA检测显示抗体效价达1∶640 000；Western blot结果证实，该抗血清能特异性识别目的蛋白；间接免疫荧光结果显示，该多克隆抗体能很好地识别TGF‑β1阳性细胞。综上，本研究制备出的兔抗鸡TGF‑β1多克隆抗体，可用于鸡TGF‑β1的检测。

Abstract

The polyclonal antibodies against chicken transforming growth factor β1 （TGF‑β1） was prepared. Firstly， the CDS region of the chicken TGF‑β1 gene was amplified by RT‑PCR using the mRNA of Marek's disease virus transformed T lymphocyte line MSB1 cell as the template， and then the fragment was ligated into the prokaryotic expression vector pET‑32a （+） for the construction of the recombinant plasmid pET‑32a‑TGF‑β1. Subsequently， the recombinant expression plasmid was transformed into the Escherichia coli expression strain BL21 and induced for expression. The recombinant expressed protein was purified by affinity chromatography. Then， polyclonal antibodies were prepared by immunizing rabbits， and the antibody titer was detected by indirect ELISA. The specificity of the polyclonal antibodies was evaluated by Western blot and indirect immunofluorescence. The results demonstrated that the successful construction of the recombinant prokaryotic expression plasmid pET‑32a‑TGF‑β1， and a recombinant protein of approximately 65 kDa was obtained after induction with IPTG. Rabbit anti-chicken TGF‑β1 antiserum was obtained by immunizing rabbits， and the antibody titer was 1∶640 000 as detected by ELISA. Western blot results showed that the rabbit anti‑chicken TGF‑β1 antiserum could specifically recognize the target protein， and indirect immunofluorescence results indicated that the polyclonal antibody could well recognize TGF‑β1 positive cells. In conclusion， polyclonal antibodies against chicken TGF‑β1 with good specificity were successfully prepared， and can be used for the detection of chicken TGF‑β1.

Graphical abstract

关键词

鸡 / TGF‑β1 / 原核表达 / 抗体 / 多克隆抗体

Key words

chicken / TGF‑β1 / prokaryotic expression / antibody / polyclonal antibody

0 引言

转化生长因子β（Transforming growth factor β，TGF-β）超家族是由一类结构与生物学特性相似的细胞因子组成，在细胞增殖、免疫细胞功能调节、细胞凋亡、细胞迁移、血管生成与上皮—间质转化（Epithelial‑mesenchymal transition， EMT）等方面具有重要的调控功能，在多种疾病的发生过程中发挥重要的调节作用^［1-3］。

转化生长因子β1是TGF-β超家族成员，其分子构型是由两个结构相近的亚基通过非共价结合形成的同源二聚体。TGF‑β1在TGF‑β家族体系中占比大、活性高，是一种能参与多种生物学功能和病理生理过程的多效性细胞因子，主要以自分泌、旁分泌和内分泌的方式，通过细胞表面的TGF‑β Ⅰ型和Ⅱ型受体信号转导途径^［4-6］，发挥调控细胞增殖、促进细胞转化与分化、促进血管生成与引起免疫抑制等生物学功能^［7-10］。TGF‑β1在肿瘤进展中表现出双重功能。在肿瘤发生早期，由肿瘤细胞或间质细胞释放的TGF‑β1能够抑制细胞周期进程，主要通过阻断G1期向S期的转换，从而诱导细胞增殖停滞并促进凋亡，此时其主要发挥肿瘤抑制效应。在肿瘤进展期，由于肿瘤抑制基因的功能缺失突变和获得致癌突变而对TGF‑β1的肿瘤抑制作用产生抵抗，TGF‑β1的功能转变为肿瘤启动子而发挥肿瘤促进作用^［11］。

上皮‑间充质转化在多种病理过程及肿瘤发生发展中起关键作用，是驱动肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的关键因素。TGF‑β1信号通过促进EMT，增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力，从而促进肿瘤恶性进展^［12-14］。WANG等^［15］研究表明，STAT3作为正调控因子，激活TGF‑β1诱导的肝癌EMT及转移过程，STAT3和Snail‑Smad3/TGF‑β1信号通路在HCC中协同促进EMT和迁移。YANG等^［16］研究表明，B16黑色素瘤细胞中的Notch1信号通路可能通过上调TGF‑β1来抑制抗肿瘤免疫。NAKAMURA等^［17］研究发现，在肿瘤和前哨淋巴结中，TGF‑β1的过度产生可能抑制自发的抗肿瘤CD8⁺ T细胞反应，是产生免疫抑制微环境的关键。TGF‑β1在肿瘤进展中兼具抑制和促进作用，这种功能上的双重性及其复杂的多效性，使其在肿瘤发病机制研究领域受到广泛关注。

马立克病（Marek's disease，MD）是一种由马立克病病毒（Marek's disease virus，MDV）感染引起的高度传染性禽类疾病，其病理特征主要包括T细胞淋巴瘤的形成、神经系统症状以及机体免疫抑制。随着疫苗的长期使用，MDV流行毒株的毒力不断演变，甚至出现疫苗不能提供有效保护的特强毒株，对家禽养殖业构成严重威胁^［18-21］。目前，TGF‑β1在人和小鼠肿瘤发展过程中的调控作用研究较为深入，但鸡TGF-β1的相关功能研究主要集中在其作为关键调控因子，在肌肉发育、骨骼疾病及家禽育种中的作用机制上。鸡TGF‑β1在MDV等诱导发生的免疫抑制和肿瘤发生过程中的功能还需要进一步研究。

在开展鸡TGF‑β1的相关功能研究时，高质量的特异性多克隆抗体是开展此类深度研究的核心工具，获得可靠的特异性抗体后，研究才能从基因和细胞水平深入到更精确的蛋白水平。TGF‑β1商业抗体多针对人、小鼠等哺乳动物制备，由于鸡与哺乳动物的TGF‑β1蛋白序列存在差异，使用异源抗体可能导致交叉反应性差、背景信号高、假阴性或假阳性结果，且目前国内尚无商品化的鸡TGF‑β1抗体产品。因此，本研究构建鸡TGF‑β1原核表达载体，诱导后获得鸡TGF‑β1重组表达蛋白，用纯化蛋白免疫家兔制备兔抗鸡TGF‑β1的多克隆抗体，为后续检测鸡TGF‑β1蛋白及其功能提供试验材料。

1 材料与方法

1.1 材料

E.coli DH5α和BL21、pUC57、pET‑32a（+）原核载体、pDC316‑mCMV‑Gallus‑TGF‑β1质粒、家兔、马立克病毒转化的淋巴细胞系MSB1、DF‑1细胞等由实验室提供；反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、EcoR I、Xho I、T4DNA连接酶、DNA Marker和ECL发光试剂盒等购自TaKaRa公司；TRIzol试剂购自天根生化科技（北京）有限公司；PVDF膜、Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自塞维尔生物科技有限公司；质粒DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；镍亲和层析柱购自生工生物工程（上海）有限公司；弗氏佐剂购自Sigma公司；脱脂奶粉、HRP‑羊抗兔IgG与ELISA反应板购自上海碧云天生物技术有限公司；蛋白Marker购自南京金斯瑞生物科技有限公司；TMB显色液、IPTG、咪唑与Tween‑20等购自北京索莱宝科技有限公司；RPMI 1640、DMEM培养基、胎牛血清与双抗均购于Gibco公司；胰蛋白胨磷酸肉汤购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 鸡TGF‑β1特异性引物的设计与合成

基于GenBank中鸡TGF‑β1基因（NM‑001318456.1）的CDS区序列（1179 bp）及pET‑32a（+）载体的多克隆位点，设计合成扩增该基因的特异性引物，上游引物序列为：5'‑GCGAATTCATGGATCCGAGCCCGCT‑3'（下划线处为EcoR I酶切位点）；下游引物序列为：5'‑CGCTCGAGACTGCATTTACAGGCA‑3'（下划线处为Xho I酶切位点），由生工生物工程（上海）有限公司合成，预期扩增产物大小为1195 bp。

1.2.2 鸡TGF‑β1基因的扩增

收集含10%胎牛血清、1%双抗和10%胰蛋白胨磷酸肉汤，在RPMI 1640培养基中培养至对数生长期，生长状态良好的MDCC‑MSB1细胞，利用TRIzol试剂提取方法提取MDCC‑MSB1细胞总RNA，反转录为cDNA后，以cDNA为模板，使用合成的鸡TGF-β1基因特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下：10× PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L） 2 μL，模板cDNA 1 μL，上游引物（10 μm/L）1 μL，下游引物（10 μm/L）1 μL， Taq DNA聚合酶0.5 μL，去离子水17 μL，总25 μL。PCR扩增程序设定为：95 ℃预变性3 min；随后进行30个循环，每个循环包括95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s和72 ℃延伸90 s；循环结束后，再于72 ℃延伸10 min，最后于4 ℃保温。

PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化目标基因片段。

1.2.3 pET‑32a‑TGF‑β1重组表达载体的构建及鉴定

将回收的鸡TGF‑β1基因片段与pET‑32a（+）分别用EcoRI/XhoI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收酶切产物中的目的片段及载体大片段，再经T4 DNA连接酶将二者连接。连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含Amp⁺ LB固体培养基上培养，筛选阳性重组子，经双酶切及测序鉴定正确后，获得重组质粒，并命名为pET‑32a‑TGF‑β1。

1.2.4 重组pET‑32a‑TGF‑β1的诱导表达

将构建的重组质粒pET‑32a‑TGF‑β1和pET‑32a质粒分别转化感受态细胞E.coli BL21（DE3），涂布于含Amp⁺（100 g/L）的LB固体平板，37 ℃恒温培养箱培养12~16 h后挑取单个菌落接入5 mL含Amp⁺（100 mg/mL）LB液体培养基，于37℃过夜培养，获得pET‑32a‑TGF‑β1‑BL21菌液和pET‑32a‑BL21菌液。将阳性克隆按1∶100接种于含有Amp⁺的10 mL LB培养基中，于37 ℃振摇培养至A600约为0.6。取出部分菌液，在剩余菌液中加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，继续于37 ℃振摇诱导表达。诱导6 h后取菌液经超声处理后进行裂解，分别收集裂解上清和沉淀。分别取未诱导的菌液、诱导后的菌液，以及两种菌液经超声破碎后的上清与沉淀组分，通过SDS‑PAGE电泳分析pET‑32a‑TGF‑β1融合蛋白的表达情况。

1.2.5 鸡TGF‑β1表达蛋白的纯化

按1∶100的比例将pET‑32a‑TGF‑β1‑BL21菌液接种至100 mL含Amp⁺ 的LB液体培养基，加入浓度为1 mmol/L的IPTG诱导6 h，于4 ℃、8000 r/min离心10 min收集菌体，用PBS（pH7.4）洗涤3次，加入Buffer B重悬，超声破碎菌体，在4 ℃条件下以8000 r/min离心10 min，获得沉淀组分。随后使用包涵体洗涤液对沉淀进行重悬，并以相同条件离心收集沉淀，上述洗涤步骤共重复两次。加入Binding Buffer，置于4 ℃过夜，12 000 r/min离心10 min，收集上清，用0.22 μm过滤。取出镍柱，用Binding Buffer洗层析柱，重复该步骤2次。将待纯化的蛋白样品上柱，用Washing Buffer清洗层析柱，此步骤重复4次。向层析柱中加Elution Buffer进行洗脱，使用EP管收集提纯的融合蛋白，置于-80 ℃保存。

1.2.6 鸡TGF‑β1多克隆抗体的制备与检测

将纯化的蛋白按照文献［22］方法进行复性，经Bradford蛋白浓度测定试剂盒定量后，初次免疫按照200 µg蛋白/只的量将蛋白与弗氏完全佐剂按照1∶1体积比混匀，完全乳化后多点注射于家兔的颈背部皮下。注射3周后，按照100 µg蛋白/只的量，将蛋白与弗氏不完全佐剂按照1∶1体积比混匀进行二次免疫。之后按照每隔3周免疫1次，总共免疫4次。在最后一次免疫后7 d进行心脏采血，分离血清，分装后置于-80 ℃保存。采用间接ELISA检测血清抗体滴度。酶标板先用纯化的TGF-β1融合蛋白（10 mg/L，100 µL/孔）于4 ℃包被过夜，用5% BSA封闭液（100 µL/孔）37 ℃ 封闭2 h，洗涤后加入倍比稀释的家兔抗血清（100 µL/孔），同时设未免疫家兔血清作阴性对照，37 ℃孵育1 h。洗板后加入稀释的HRP-羊抗兔IgG（100 µL/孔）于37 ℃孵育1 h。加入底物TMB（100 µL/孔）避光显色10 min后加2 mol/L H₂SO₄（50 µL/孔）中止反应。酶标仪检测OD_{450 nm}值，判定抗血清的抗体效价。

1.2.7 鸡TGF‑β1抗血清特异性鉴定

Western blot鉴定：取诱导后的pET‑32a‑TGF‑β1‑BL21菌蛋白样品进行SDS‑PAGE电泳，完成电泳后在100 V电压状态下转膜90 min。转膜结束后，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10 min；用封闭液室温封闭30 min，加入兔抗鸡TGF‑β1抗血清稀释液，4 ℃孵育过夜；次日洗涤后加入HRP‑羊抗兔IgG，4 ℃孵育2 h；用化学发光仪曝光成像。间接免疫荧光试验（IFA）：pDC316‑mCMV‑Gallus‑TGF‑β1质粒转染DF‑1细胞48 h后，用预冷甲醛/丙酮（1∶1）4 ℃固定10 min；PBS洗涤后用0.5% Triton-100通透细胞；加入1% BSA（100 µL/孔）室温封闭1 h；PBS洗涤后加入制备的兔抗鸡TGF-β1抗血清稀释液（100 µL/孔，同时设未免疫兔的血清稀释液作为阴性对照）于4 ℃孵育过夜；次日洗涤后加入稀释的FITC‑羊抗兔IgG（100 µL/孔）于室温孵育1 h；PBS洗涤后用荧光显微镜观察。

2 结果

2.1 鸡TGF‑β1基因PCＲ扩增产物的鉴定结果

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统中观察，以MDCC-MSB1细胞总RNA的cDNA为模板的PCR扩增产物在约1200 bp处有清晰的特异性条带，大小与预期相符，而以去离子水为模板的PCR扩增产物无条带（图1）。

2.2 pET‑32a‑TGF‑β1重组质粒的鉴定

重组质粒pET32a‑TGF‑β1经EcoRI和XhoI双酶切，可见与预期大小一致的两条条带，大小分别为5900 bp和1200 bp左右 （图2），对双酶切鉴定正确的重组质粒进行测序，测序结果符合预期。

2.3 鸡TGF‑β1融合蛋白的诱导表达

选择重组菌pET‑32a‑TGF‑β1‑BL21与pET‑32a‑BL21，经IPTG诱导表达后，采用SDS‑PAGE检测蛋白表达情况，结果如图3所示。在重组菌pET‑32a‑TGF‑β1‑BL21诱导产物的沉淀中，出现了1条明显的蛋白条带，大小与预期相符，约为65 kDa，表明目的蛋白TGF‑β1在BL21中成功表达。

2.4 鸡TGF‑β1表达蛋白的纯化

将诱导表达的重组菌pET‑32a‑TGF‑β1‑BL21裂解后，上清用镍亲和层析柱纯化，经SDS‑PAGE获得大小约为65 kDa的纯化蛋白，与预期相符合（图4）。将纯化蛋白复性后经Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度为1.8 g/L。

2.5 多克隆抗体的检测

包括兔抗鸡TGF‑β1免疫血清ELISA效价检测和特异性检测。以鸡TGF-β1融合蛋白包被酶标板，采用间接ELISA法检测制备的鸡TGF‑β1免疫血清滴度为1∶64 000（表1）。采用Western blot和IFA检测兔抗鸡TGF‑β1免疫血清的抗原特异性。以制备的兔抗鸡TGF‑β1免疫血清作为一抗（1∶1000），分别进行pET‑32a‑TGF‑β1‑BL21诱导产物的Western blot和DF‑1细胞的IFA检测。Western blot分析结果显示，在分子量约65 kDa处出现一条特异性目的条带（图5）。IFA检测结果显示，与兔抗鸡TGF‑β1免疫血清反应的DF‑1细胞在荧光显微镜下呈现特异性绿色荧光，而阴性对照未见荧光信号（图6）。结果表明，制备的兔抗鸡TGF‑β1多克隆抗体具有良好的抗原特异性。

3 讨论

转化生长因子β1 （TGF‑β1）是机体生命活动重要的细胞因子。在正常情况下，TGF‑β1对机体免疫细胞的发育、成熟与维持免疫耐受和体内平衡以及调节免疫应答等方面至关重要^［7-8］。作为一种调控多种细胞功能及病理生理过程的多效性细胞因子，在异常状态下也发挥着重要的作用，例如慢性损伤、严重创伤或感染可能会引起组织愈合过程的主要调节因子TGF‑β1的作用异常，从而导致损伤从生理性修复转向过度病理性修复^［23-24］。此外，TGF‑β1在机体肿瘤发生、发展中具有重要作用，包括细胞增殖、分化、凋亡及迁移等^{［11， 15， 17， 25］}。现有研究多体现在TGF‑β1对哺乳动物机体的作用，TGF‑β1在家禽机体生命活动方面的研究相对较少。ZHOU等^［26］研究发现，在鸡卵泡生长过程中，TGF‑β1通过刺激GCs分泌胶原蛋白，促进细胞增殖，进而通过细胞间合作模式促进卵泡发育。LI等^［27］的研究表明，TGF‑β1可通过调节MyoD和myogenin的表达抑制骨骼肌生长。WANG等^［28］发现H9N2病毒感染可促进TGF‑β1表达上调，从而增强APEC的黏附能力。因此，靶向TGF‑β1及其相关信号通路可为临床治疗H9N2感染诱导的大肠杆菌继发性感染提供依据。

TGF‑β1与调节性T细胞（Treg）在生物学上联系密切，CD4⁺ T细胞中的Tregs是TGF‑β1的主要产生细胞之一^［7］。马立克病病毒（MDV）是一种α疱疹病毒，感染鸡后可引起CD4⁺ T细胞转化为致命淋巴瘤，且免疫抑制也发生于疾病的转化阶段。GURUNG等^［29］研究发现，在MDV易感鸡的脾脏中TGF‑β⁺ Treg细胞的比例明显高于抗性鸡，表明TGF‑β⁺ Treg细胞在MD淋巴瘤形成过程中具有重要的作用。

前期研究也发现鸡TGF‑β1可以抑制MDV转化的肿瘤细胞MSB1细胞的增殖，促进其凋亡，但尚需进一步探究鸡TGF‑β1在MD发生中的具体作用和机制^［30］。因此，在体外成功制备鸡TGF‑β1蛋白及其高效价特异性抗体具有重要的研究意义。通过基因工程手段在体外表达蛋白，是大量获取TGF‑β1蛋白的一种有效且简单的方法。

本研究在成功构建鸡TGF‑β1的原核表达载体后，将其转化至感受态细胞E.coli BL21（DE3）中，并使用IPTG进行诱导表达。随后收集菌体，经破碎后分离沉淀与上清组分，经SDS‑PAGE鉴定，发现大小约为65 kDa的目的蛋白主要在破碎后的沉淀中，表明表达的目的蛋白是包涵体表达蛋白。采用亲和镍柱法对所得包涵体蛋白进行纯化，获得了高纯度的重组TGF‑β1蛋白。对纯化的TGF‑β1蛋白进行复性，与弗氏完全佐剂或不完全佐剂混合乳化后免疫家兔，制备多克隆抗血清。采用间接ELISA法检测结果显示，所制备的多克隆抗体效价不低于l∶64 000，Western blot检测结果显示制备的鸡TGF‑β1多克隆抗体可以识别特异性融合表达蛋白，间接免疫荧光检测显示制备的鸡TGF‑β1多克隆抗体可以特异性识别鸡DF‑1细胞中过表达的鸡TGF‑β1蛋白。通过不同方法鉴定表明，成功获得抗鸡TGF‑β1多克隆抗体，为后续研究鸡TGF‑β1的生物学功能及其在MD免疫抑制和肿瘤发生中的作用对MDCC‑MSB1细胞增殖、凋亡的调控机制奠定了基础。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31702207)

国家自然科学基金项目(32472990)