牛轮状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

Establishment and application of a real‑time fluorescent quantitative PCR assay for Bovine Rotavirus

摘要

基于NCBI数据库中牛轮状病毒 （Bovine rotavirus，BRV） VP7基因的保守序列设计特异性引物，通过优化反应体系与扩增条件，建立BRV SYBR Green Ⅰ RT‑qPCR检测方法。实验结果表明，最佳退火温度为52 ℃，引物最佳终浓度为0.8 μmol/L；在3.16×10³~3.16×10⁷ copies/μL的DNA拷贝数范围内，模板浓度与C_t 值呈良好线性关系（R²=0.998 9），最低检测限为3.16×10¹ copies/μL，较常规PCR方法的灵敏度提升约100倍。特异性与重复性验证显示，该方法仅对BRV产生特异性扩增带，犊牛腹泻常见病原均未出现非特异性扩增信号；组内与组间变异系数均小于1%。对60份疑似BRV感染的粪便样品进行检测，阳性检出率为21.7%，显著高于常规PCR方法的13.3%。综上，所建立的RT‑qPCR方法具有高特异性、灵敏度和重复性，可用于BRV的临床快速检测及诊断试剂盒的研发。

Abstract

Specific primers were designed based on the conserved sequences of the VP7 gene of Bovine rotavirus （BRV） retrieved from the NCBI database. By optimizing the reaction system and amplification conditions， a SYBR Green Ⅰ RT‑qPCR assay for BRV detection was established. Experimental results showed that the optimal annealing temperature was determined as 52 °C and the optimal final concentration of the primers was 0.8 μmol/L. A good linear relationship （R²=0.998 9） was observed between the template concentration and the C_t value within the range of 3.16×10³~3.16×10⁷ copies/μL， with the minimum detection limit of 3.16×10¹ copies/μL， which represented a 100 fold increase in sensitivity compared with the conventional PCR method. Specificity and repeatability verification tests indicated that the established assay produced specific amplification bands only for BRV， and no non‑specific amplification signals were detected for other common pathogens causing calf diarrhea. The coefficients of variation （CVs） of both intra‑assay and inter‑assay were less than 1%. A total of 60 fecal samples suspected of BRV infection were detected， and the positive detection rate was 21.7%， which was significantly higher than that of the conventional PCR method （13.3%）. In conclusion， the established RT‑qPCR assay exhibited high specificity， sensitivity and repeatability， and could be applied for the rapid clinical detection of BRV and the development of diagnostic kits.

Graphical abstract

关键词

牛轮状病毒 / VP7基因 / 荧光定量RT‑qPCR / 诊断

Key words

Bovine Rotavirus / VP7 gene / fluorescence quantitative RT‑qPCR / diagnosis

0 引言

轮状病毒已被证实是造成5岁以下儿童重症腹泻的主要病原体，同时在全球多种幼年动物群体中广泛存在^［1］。此外，轮状病毒常作为其他腹泻性疾病的诱因或并发症^［2］，对人类健康与畜牧业生产均构成严重威胁，因此受到国内外学者的高度关注。2021年世界卫生组织正式倡导将轮状病毒疫苗纳入各个国家的免疫规划。

牛轮状病毒感染是一种急性胃肠道传染病，在全球范围内对养牛业造成严重影响并带来巨大经济损失。该病的病原为牛轮状病毒（Bovine rotavirus， BRV），隶属于轮状病毒科，主要侵害犊牛，临床以呕吐、腹泻及脱水为典型症状^［3-4］。BRV感染的典型病理变化包括：病畜胃内存在凝乳块，小肠壁变薄呈透明状，肠内容物为灰黄或灰黑色液体，肠系膜淋巴结肿大，同时伴随小肠绒毛萎缩与变短。BRV主要经粪‑口途径传播，病毒主要在肠道内大量复制后随粪便排出，污染饮水、饲料、器具及周边环境，进而通过消化道感染健康牛只^［5］。亦有研究推测，BRV可能通过气溶胶微粒实现空气传播，但目前尚无直接证据支持该观点^［6］。

BRV属于RNA病毒，其病毒粒子无包膜，呈二十面体对称结构，完整颗粒直径约为70 nm，具有双层衣壳，因形态类似车轮而得名^［7］。该病毒的细胞培养与复制存在较大挑战，其增殖通常局限于特定动物来源的细胞品系，且复制过程中产生的细胞病理效应相对温和；值得注意的是，导致犊牛腹泻型BRV可在恒河猴胎儿肾脏的MA‑104细胞中有效复制，并引发明显的细胞病变。目前，已经鉴定出A组轮状病毒包含42种G基因型与58种P基因型^［8-9］，由于其基因组由多个片段组成，不同来源的病毒感染细胞可能发生基因重配（尤其在同血清型病毒间），这种遗传重组事件可能催生新的病毒株。BRV的基因组由11个双链RNA片段组成，共编码6种结构蛋白（VP1—VP4、VP6和VP7）和6种非结构蛋白（NSP1—NSP6）^［10］。其中，VP6蛋白作为内壳蛋白，是轮状病毒的群特异性抗原，其编码基因在人及多种动物轮状病毒中保守性最高，因此成为检测研究的首选靶点^［11］。外衣壳蛋白VP4与VP7分别负责诱导宿主产生中和抗体，并决定病毒的P和G基因型，在疫苗研究中应用广泛。尤其重要的是，VP7蛋白作为BRV的外衣壳糖蛋白，不仅是中和抗体的关键靶点，其编码基因在同血清型不同毒株间高度保守^［10-11］，且参与病毒入侵宿主细胞过程中的膜置换与膜破坏^［12-13］。在BRV感染阶段，VP7蛋白可与宿主细胞表面的整合素发生相互作用，进而调控病毒对宿主细胞的侵入效率^［14］，在病毒致病机制中发挥核心作用。

拟选取BRV的VP7基因保守序列为靶向位点，设计特异性引物（其结合区域分别对应VP7基因第2—359位与第62—246位核苷酸序列），构建基于核酸诊断技术的BRV临床快速检测方法。

1 试验材料与方法

1.1 毒株及临床样品

牛病毒性腹泻病毒1型（Bovine viral diarrhea virus type 1，BVDV‑1）、牛细小病毒1型（Bovine parvovirus type 1，BPV‑1）、牛细小病毒2型（Bovine parvovirus type 2，BPV‑2）、牛冠状病毒（Bovine coronavirus，BcoV）、大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）及鼠伤寒沙门菌（S.Typhimurium）均由本实验室保藏；60份疑似BRV感染的犊牛腹泻粪便样品，采集自河南洛阳地区的不同规模化牛场。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒与cDNA链合成试剂盒均购自湖南艾科瑞生物科技有限公司；OMEGA品牌DNA凝胶纯化试剂盒及质粒小量提取试剂盒购自陕西德裕生物科技有限公司；Taq^TM（R001A）、CloneAmp^TM HiFi PCR Premix（639298）、pMD‑19T克隆质粒、DNA Marker及各类限制性内切酶，均购自大连宝生物科技有限公司。

1.3 引物设计及合成

以NCBI数据库上传的不同BRV毒株的VP7基因序列为参考，使用生物软件比对获取VP7基因的保守序列，并设计两类特异性引物：（1）BRV‑VP7‑F/BRV‑VP7‑R引物对，用于常规PCR鉴定，预期扩增片段长度为358 bp；（2）BRV‑F/BRV‑R 引物对，用于构建BRV RT‑qPCR特异性检测方法，引物详细信息见表1。

1.4 质粒标准品构建与鉴定

以BRV的RNA为模板，采用试剂盒配套的随机引物将其反转录为cDNA；利用BRV‑VP7‑F/R引物对扩增获得VP7基因片段，并将其克隆至pMD‑19T载体，成功构建重组质粒pMD‑19T‑VP7。该重组质粒经鉴定后，作为后续 DNA 拷贝数计算的质粒标准品，拷贝数计算公式如下：

\mathrm{拷贝}\mathrm{数}=\frac{\mathrm{6.02}\times {\mathrm{10}}^{\mathrm{23}}\times \mathrm{质粒}\mathrm{质量}\mathrm{浓度}}{\mathrm{660}\times \mathrm{D}\mathrm{N}\mathrm{A}\mathrm{长度}(\mathrm{碱基}\mathrm{数})}。

1.5 RT‑qPCR反应条件优化

以pMD‑19T‑VP7重组质粒为阳性模板，分别设置不同的引物浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L）和退火温度（49、50、51、52、53、54 ℃），筛选该RT‑qPCR检测方法的最优引物浓度与最适退火温度。在此基础上，进一步将质粒标准品pMD‑19T‑VP7连续10倍比稀释，实施荧光定量PCR扩增，以拷贝数浓度的对数值为横坐标，C_t 值为纵坐标，绘制曲线。

1.6 特异性试验

以犊牛腹泻常见病原（BVDV‑1、BPV‑1、BPV‑2、E. coli、S. Typhimurium）的DNA或cDNA为模板，对所建立的检测方法开展特异性验证试验。

1.7 敏感性试验

将质粒标准品连续10倍比稀释，获得浓度梯度为3.16×10¹~3.16×10⁹ copies/μL的模板溶液，采用本研究建立的检测方法对各梯度稀释液进行扩增检测，以此评价该方法的灵敏度。

1.8 重复性试验

以浓度梯度为3.16×10²~3.16×10⁶ copies/μL的pMD‑19T‑VP7质粒标准品为模板，建立的检测方法进行RT‑qPCR扩增，每个样品均设置4个重复孔，用于组内重复性验证。同时，在相同反应条件下，于不同时间点开展4次独立重复试验，通过计算平均值、标准差及变异系数，对组内以及组间检测的重复性进行评估。

1.9 实用性检测

为了进一步验证本方法的临床实用性及准确性，采用该方法对收集的60份疑似感染的犊牛腹泻粪便样本进行检测，并将检测结果与常规PCR及文献［15］报道的检测方法进行比较，综合评价该方法的临床应用价值与检测可靠性。

2 试验结果

2.1 质粒标准品pMD‑19T‑VP7的构建及鉴定

以提取BRV的cDNA为模板，采用BRV‑VP7‑F/R引物对进行PCR扩增，将扩增得到的目的基因片段克隆至pMD‑19T载体。PCR 扩增结果显示，成功获得长度为358 bp的目的基因条带（图1）。测序比对结果表明，该扩增片段的核苷酸序列与预期序列同源性达 100%。

2.2 反应条件优化及标准曲线的建立

RT‑qPCR检测结果显示，在退火温度为52 ℃，引物浓度为0.8 μmol/L的条件下，扩增曲线C_t 值最小且荧光强度最强，为最佳反应条件（图2）。

以浓度3.16×10³~3.16×10⁷ copies/μL的pMD‑19T‑VP7重组质粒标准为模板，每个浓度设置4个重复孔，采用本研究建立的RT‑qPCR方法进行检测，得到相应的扩增曲线（图3A）。以DNA拷贝数浓度的对数值为X轴，C_t 值为Y轴构建标准曲线，得到的线性回归方程为：Y=-3.449 8X+29.785，R²=0.995 6（图3B）。溶解曲线分析结果显示，仅在72.5 ℃±0.5 ℃处出现单一特征峰（图3C），表明该检测方法具有良好的扩增效率，在3.16×10³~3.16×10⁷ copies/μL的DNA拷贝数范围内与C_t 值有良好的线性关系。

2.3 特异性试验

以犊牛腹泻常见病原（BVDV‑1、BPV‑1、BPV‑2、E. coli、S. Typhimurium）的cDNA或DNA为模板，利用所建立的检测方法开展特异性验证试验。结果显示，仅BRV阳性样品与pMD‑19T‑VP7重组质粒出现信号（图4），表明该检测方法具备良好的特异性。

2.4 敏感性试验

将pMD‑19T‑VP7质粒稀释后换算为不同的DNA拷贝数（3.16×10¹~3.16×10⁹ copies/μL），利用建立的检测方法进行RT‑qPCR扩增。结果显示，RT‑qPCR在检测下限为3.16×10¹ copies/μL时仍然有检测信号（图5），显著高于常规的PCR检测限（图6）。对比可知，本研究建立的RT‑qPCR方法的检测灵敏度较常规PCR方法提升至少100倍。

2.5 重复性试验

以拷贝数为3.16×10²~3.16×10⁶ copies/μL的质粒为模板，利用RT‑qPCR方法进行扩增，每个浓度设置4个平行重复，分别开展组内与组间重复性验证试验。结果显示，组内重复试验的变异系数范围为（0.20%，0.82%）；组间重复性试验变异系数范围为（0.32%，0.89%）。组内与组间变异系数均小于1.00%（表2），表明该方法具有良好的稳定性与重复性。

2.6 临床样品的检测

利用所建立的方法对临床疑似感染的犊牛腹泻样品进行检测，结果显示本方法检出的阳性率为21.7%（13/60），常规PCR的阳性检出率为13.3%（8/60），两种方法的检测结果符合率达 100%，且本方法的阳性检出率较常规 PCR 方法高出约 8.4 个百分点。同时，与文献［15］报道的基于NSP5基因所建立的BRV RT‑qPCR检测方法进行对比，二者的阳性符合率为92.3%，阴性符合率为97.9%，具有较好的一致性，表明该检测方法能够用于临床中牛群BRV感染的检测诊断。

3 讨论

BRV是一种潜在的人畜共患肠道病原体，不仅严重威胁犊牛健康，还会给畜牧养殖行业造成巨大的经济损失^［16］。轮状病毒主要通过粪‑口途径传播，是引发犊牛腹泻的常见病原，可通过导致患病动物死亡或阻碍其生长发育等途径，直接造成养殖经济损失^［17-18］。

目前，针对轮状病毒的检测方法大多以VP6和NSP3基因为靶标^［19-20］，而围绕VP7基因的相关检测研究相对较少。通过比对NCBI数据库公布的BRV VP7基因序列，设计特异性引物，成功建立了一种基于VP7基因的BRV特异性荧光定量PCR检测方法。以浓度为3.16×10³~3.16×10⁷ copies/μL的pMD19‑T‑VP7重组质粒标准样品为模板构建标准曲线，所得线性回归方程的相关系数R²为0.995 6，表明该方法在上述浓度范围内具有良好的线性关系。以BVDV‑1、BPV‑1、BPV‑2、E. coli和S. Typhimurium等病原核酸为模板时，与陈军震等^［21］建立的多重液滴数字PCR（ddPCR）方法（最低检测浓度为1000 copies/μL）相比，本文的检测灵敏度更高。

为进一步验证该检测方法的可靠性与实用性，对来自不同养殖场的60份疑似BRV感染的临床腹泻牛粪便样品进行检测。结果显示，检出的阳性率为21.7%（13/60），显著低于于文博等^［22］采用间接免疫荧光法在其他省份所测得的70.8%（34/48）阳性率，这可能与地域差异及样本量偏少相关。本方法的阳性检出率高出约8.4个百分点，且两种方法的检测结果符合率达100%；与文献［15］报道的基于NSP5基因的BRV RT‑qPCR检测方法对比，二者的阳性符合率为92.3%，阴性符合率为97.9%，进一步证实了该方法的可靠性，为研发BRV检测试剂盒提供理论数据参考。

参考文献

[1] HUANG Y， LI Z， FU Y， et al. Diagnosis of bovine rotavirus： An overview of currently available methods［J］. Front Microbiol， 2025， 16： 1550601.

[2] ALKOSHI S， ERNST K， MAIMAITI N， et al. Rota viral infection： A significant disease burden to libya［J］. Iran J Public Health， 2014， 43（10）： 1356‑1363.

[3] BARSOUM Z. Regional hospitalisation and seasonal variations of Pediatric rotavirus gastroenteritis pre‑and post‑RV vaccination： A prospective and retrospective study［J］. World J Pediatr， 2022， 18（6）： 404‑416.

[4] MIYABE F M， AGNOL A M D， LEME R A， et al. Porcine rotavirus B as primary causative agent of diarrhea outbreaks in newborn piglets［J］. Sci Rep， 2020， 10（1）： 22002.

[5] SANTIANA M， GHOSH S， HO B A，et al. Vesicle‑cloaked virus clusters are optimal units for inter-organismal viral transmission［J］. Cell Host Microbe， 2018， 24（2）： 208‑220，e208.

[6] DENNEHY P H. Transmission of rotavirus and other enteric pathogens in the home［J］. Pediatr Infect Dis J， 2000， 19（S10）： S103‑105.

[7] YAN Wenjun， HUANG Siyu， ZHANG Lan， et al. Virus‑like particles vaccine based on co‑expression of G5 Porcine rotavirus VP2‑VP6‑VP7 induces a powerful immune protective response in mice［J］. Vet Microbiol， 2024， 298： 110241.

[8] AKSOY E， AZKUR A K. Genome characterization of a Turkish bovine rotavirus field isolate by shotgun metagenomics［J］. Arch Virol， 2023， 168（6）： 159.

[9] CHENG X， WU W， TENG F， et al. Isolation and characterization of Bovine RVA from northeast China， 2017—2020［J］. Life （Basel）， 2021， 11（12）： 1389.

[10] VLASOVA A N， AMIMO J O， SAIF L J. Porcine rotaviruses： Epidemiology， immune responses and control strategies［J］. Viruses， 2017， 9（3）：48.

[11] POSSATTI F， LORENZETTI E， ALFIERI A F， et al. Genetic heterogeneity of the VP6 gene and predominance of G6P［5］ genotypes of Brazilian porcine rotavirus C field strains［J］. Arch Virol， 2016， 161（4）： 1061‑1067.

[12] LIU Xiaoying， YAN Nan， YUE Hua， et al. Detection and molecular characteristics of bovine rotavirus A in dairy calves in China［J］. J Vet Sci， 2021， 22（5）： e69.

[13] UDDIN A N， KHAIR A， HASSAN J， et al. Risk factors for bovine rotavirus infection and genotyping of bovine rotavirus in diarrheic calves in Bangladesh［J］. PLoS One， 2022， 17（2）： e0264577.

[14] 雷蕾， 徐晨夏， 汪嘉仪， 等. G8P［1］型牛轮状病毒的分离和基因组特征［J］. 中国兽医科学， 2025， 55（3）： 299‑307.

[15] LEI Lei， XU Chenxia， WANG Jiayi， et al. Isolation and genomic characterization of G8P［1］ bovine rotavirus［J］. Chinese Veterinary Science， 2025， 55（3）： 299‑307.

[16] 于德斌， 曹存， 徐晓静， 等. 牛轮状病毒NSP5基因SYBR Green Ⅰ荧光定量RT‑PCR检测方法的建立与应用［J］. 中国预防兽医学报， 2021， 43（4）： 399‑404， 424.

[17] YU Debin， CAO Cun， XU Xiaojing， et al. Establishment and application of SYBR Green Ⅰ real‑time RT‑PCR for detecting NSP5 gene of bovine rotavirus［J］. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine， 2021， 43（4）： 399‑404， 424.

[18] QIN Songkang， LI Kuanhao， LIU Benjin， et al. Efficient and robust reverse genetics system for bovine rotavirus generation and its application for antiviral screening［J］. Virol Sin， 2024， 39（6）： 917‑928.

[19] LIU Yuelin， LIU Libing， WANG Jinfeng， et al. Rapid detection of bovine rotavirus A by isothermal reverse transcription recombinase polymerase amplification assays［J］. BMC Veterinary Research， 2022， 18（1）： 339.

[20] STRYDOM A， DONATO C M， NYAGA M M， et al. Genetic characterisation of south African and mozambican bovine rotaviruses reveals a typical bovine‑like artiodactyl constellation derived through multiple reassortment events［J］. Pathogens， 2021， 10（10）： 1308.

[21] 柳佳佳， 梁海英， 曾智勇， 等. 猪轮状病毒TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测方法的建立与应用［J］. 中国兽医科学， 2024， 54（2）： 162‑168.

[22] LIU Jiajia， LIANG Haiying， ZENG Zhiyong， et al. Establishment and application of TaqMan real-time fluorescence quantitative RT‑PCR for detection of porcine rotavirus［J］. Chinese Veterinary Science， 2024， 54（2）： 162‑168.

[23] 吴畏， 耿旭， 陈铭泽， 等. 检测牛轮状病毒抗体的双抗原夹心ELISA方法的建立［J］. 中国兽医科学， 2022， 52（9）： 1073‑1079.

[24] WU Wei， GENG Xu， CHEN Mingze， et al. Establishment of a double-antigen sandwich ELISA method for detection of bovine rotavirus antibodies［J］. Chinese Veterinary Science， 2022， 52（9）： 1073‑1079.

[25] CHEN Junzhen， LI Dan， XU Yafang， et al. Establishment and application of multiplex droplet digital polymerase chain reaction assay for bovine enterovirus， bovine coronavirus， and bovine rotavirus［J］. Frontiers in Veterinary Science， 2023， 10： 1157900.

[26] 于文博， 迟田英， 郑辉， 等. 牛轮状病毒间接免疫荧光试验方法的建立与初步应用［J］. 中国兽医科学， 2025， 55（7）： 891‑897.

[27] YU Wenbo， CHI Tianying， ZHENG Hui， et al. Establishment and preliminary application of indirect immunofluorescence detection method for bovine rotavirus［J］. Chinese Veterinary Science， 2025， 55（7）： 891‑897.

基金资助

国家自然科学基金项目(31572489)

河南省科技攻关项目(252102111004)

河南省大学生创新训练计划项目(S202510464093)